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F3'5'H基因超表达载体构建及转化菊花的初步研究

李君君  
【摘要】:花色是菊花的主要观赏性状之一,传统的菊花花瓣颜色不仅有黄、白、紫、红、粉、雪青等多种颜色,还有各种奇异的花色类型,比如双色、间色和变色花等。但是却独缺蓝色系菊花。在蓝色花形成的相关因素中,一个关键的因素是飞燕草色素的积累,所以编码飞燕草色素的F3’5’H基因也被称作“蓝色基因”。因此,通过生物工程技术将F3’5’H基因导入菊花,开辟了培育蓝色菊花的一个新途径。本研究主要研究成果: 以矮牵牛、瓜叶菊和飞燕草为实验材料,从中克隆出了各自的F3’5’H基因,并从矮牵牛中克隆得到了增强F3’5’H基因表达的difF基因,它编码细胞色素b5。将这些基因构建成超表达载体,并转化LBA4404和GV3101两种农杆菌,分别用于菊花和拟南芥的遗传转化。 选择露地栽培和组培无菌苗两类菊花为侵染受体,露地栽培菊花品种为兼六香和红菊,无菌苗菊花品种为粉球和翻云彩桂。通过查阅文献,设计出较适合的三种不同激素配比的培养基,简化了工作量,也获得了各个菊花品种较为适合的培养基类型。从而初步建立起了菊花再生体系。 通过实验初步获得了农杆菌介导转化菊花的遗传转化体系:外植体在预培养3天后,将其放入OD_(600)=0.5的相应农杆菌LBA4404菌液中浸染8-20min,再共培养3天、延迟筛选3天。以250mg/L Carb为抑菌浓度,10mg/L Kan为抗性筛选浓度。并且Carb在愈伤继代时降至100mg/L,Kan在生根时降至5mg/L。 除了常规的遗传转化体系,本实验还尝试了以高度分化的花瓣为外植体,诱导愈伤组织,再以愈伤组织作为受体进行侵染。实验发现,此方法更易转化成功,而且PCR初步检测时目的条带很亮,说明转化效果较好。 本实验采用了4个菊花品种,3个F3’5’H同源基因及转化的农杆菌菌株组合:LBA4404-矮牵牛Hf1、LBA4404-Hf2和LBA4404-瓜叶菊F3’5’H,共12个组合。除了LBA4404-Hf1侵染翻云彩桂的组合外,其它11种组合进行PCR初步鉴定均显示有目的片段大小的条带,推测获得了抗性愈伤。目前为止,只有LBA4404-瓜叶菊F3’5’H侵染粉球这个组合获得了转化苗,共21个株系,进行PCR鉴定发现有14个株系扩增出了目的片段大小的条带,阳性检出率较高,达到了66.6%。 在培养过程中出现了一批蓝紫色愈伤,对其进行PCR初步鉴定及提取色素测其吸收峰,并进行酸碱测试。根据实验结果推测,这可能是由于转基因表达后,飞燕草色素积累所致。 同时,还做了农杆菌介导转化拟南芥方面的实验,以期为F3’5’H基因的功能研究提供基础材料。


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