基于CRISPR/Cas9系统的基因打靶研究

【摘要】：基因打靶技术是外源DNA与受体细胞染色体DNA之间发生同源重组,从而定点改变基因组遗传信息的一项技术。基因打靶技术的出现是分子生物学领域的重大突破。目前为止,基因打靶技术已成功应用于基因结构和功能的研究、基因的表达与调控研究、动植物转基因的研究和基因治疗等诸多方面。本研究是利用CRISPR/Cas9系统进行基因打靶。CRISPR/Cas9系统是目前最先进、最高效的介导基因组编辑的方法,它与ZFN系统和TALEN系统相比更具优异性,具体体现在:CRISPR/Cas9系统载体构建更为简便且成本低廉;CRISPR/Cas9系统能实现多个位点、多个基因的同时打靶。基因打靶,最为重要的是打靶效率,高的打靶效率才更易实现遗传物质的改造,更具研究价值。本研究利用CRISPR/Cas9系统,在293T细胞系及小鼠ES细胞系中建立相关实验平台,研究该系统的基因打靶,主要成果如下:1.基于CRISPR/Cas9系统对293T细胞进行基因打靶,获得了63%的高效打靶效率。2.通过对CRISPR/Cas9系统中gRNA结构及功能的研究,选用三段合成法构建了4个gRNA(Meg3-3’-gRNA,Meg3-5’-gRNA,Kcnq1ot1-3’-gRNA,Kcnq1ot1-5’-gRNA)打靶载体。3.建立一种新的打靶效率的检测方法:在两个荧光标记(樱桃红色荧光和绿色荧光)之间的绿色荧光启动子区靶位点添加终止密码子,促使中靶细胞由于移码突变均能表达两种荧光,而未中靶细胞只能表达红色荧光,最后协同流式细胞术的荧光定量分析获得细胞的打靶效率。4.经流式细胞仪分析,所选取的三个gRNA检测位点均有较高的打靶效率,打靶效率分别为50.3%,73.5%,84.5%,更进一步说明利用CRISPR/Cas9系统进行基因打靶的高效性。5.构建小鼠ES细胞的同源替换打靶载体(Meg3和Kcnq1ot1)以及相应靶点的4个gRNA载体,实现了小鼠Meg3基因及Kcnq1ot1基因的定点敲除。6.通过荧光筛选及药物筛选并结合PCR技术,成功筛选鉴定出敲除Meg3、Kcnq1ot1单基因的小鼠ES细胞,并获得Meg3-14.3%,Kcnq1ot1-11.5%的打靶效率。