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Surfactin高产菌的高通量诱变筛选、发酵过程优化及提取

李光  
【摘要】:surfactin是一种由枯草芽孢杆菌产生的生物表面活性剂之一。它是由7个氨基酸和一个长脂肪酸链组成(C13-C15)。在环境治理以及医疗方面有着巨大的利用价值。然而surfactin生产的高成本和低产率限制了其商业应用的范围。本研究主要构建了surfactin高产菌株的常压室温等离子体技术(atmospheric pressure and room temperature plasma,ARTP)诱变及高通量筛选模式,在5 L发酵罐水平对surfactin的发酵方式进行了研究并优化,并通过制备液相获得了surfactin纯品。主要研究内容如下:(1)采用ARTP对原始菌株Bacillus subilis E7进行快速诱变。以培养9 h左右的菌种为诱变初始条件,最佳诱变处理时间为220 s,根据菌株形态差异对诱变所得菌株进行表观初筛,以表观初筛为基础,进一步结合经典血平板法通过对菌株在血平板上溶血圈大小快速筛选出产surfactin菌株。(2)采用24孔深孔板代替普通三角瓶对诱变菌株进行发酵实验,以提高筛选通量。借助酶标仪对surfactin与CPC-BTB(氯化十六烷基吡啶-溴百里酚蓝)试剂反应后的颜色变化进行检测,可快速筛选出surfactin高产突变株。孔板复筛所得到的菌株使用三角瓶发酵验证,高效液相(high performance liquid chromatography,HPLC)检测结果证明突变株Bacillus subtilis SF90-5 surfactin产量由0.12 g/L提升至0.8 g/L,产量增加了7倍。ARTP快速诱变,表观初筛,溶血圈初筛,孔板复筛,多功能酶标仪快速检测,摇瓶验证,HPLC检测相结合的方法提高了筛选通量,加快了筛选进程,成功构建出surfactin高产菌株的高通量诱变筛选体系。(3)使用不同方式进行surfactin的5 L罐水平发酵,发酵结果表明直接排泡发酵液损失严重,营养物质利用率低,surfactin产率较低;添加豆油做消泡剂后无法抑制泡沫产生且对后期提取工作造成困难。最终确定以泡沫收集回流的方式进行surfactin的5 L罐水平发酵,并在该模式基础上增加消泡塔,进一步加强了回流的有效性。通气及搅拌转速的组合实验表明,二者过高会导致剧烈的起泡现象,过低无法保证菌体正常生长代谢所需溶氧,均不利于surfactin的发酵生产。经对比后在通气1 vvm,搅拌转速300 rpm条件下获得surfactin最高产量,为2.392 g/L。(4)发酵液上清酸沉处理后使用大孔树脂吸附并洗脱,得到脂肽类生物表面活性剂粗品,其surfactin含量为58.9%。使用LC/MS对粗品进行检测,表明该粗品主要由bacillomycinD、fengycin、iturin、surfactin等物质组成。使用制备型液相色谱提纯surfactin,LC/MS检测结果表明所获产物质荷比主要为1008、1022、1036、1050,分别为surfactin A、B、C、D类物质。


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