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棉花VP基因家族鉴定及其表达分析

赵小洁  
【摘要】:棉花是最重要的纤维作物,也是盐碱地的先锋作物。开展棉花耐盐性研究,提高棉花的耐盐性,充分利用我国盐碱地已成为重要的研究课题。焦磷酸酶(pyrophosphatase,PPase)是以焦磷酸(pyrophosphate,PPi)为底物的水解酶,H+-PPase(H+-translocating inorganicpyrophosphatase)是液泡膜上的一种重要质子泵,在调控细胞膨胀、H+电化学梯度、无机离子、有机酸和糖类等次级主动运输过程中发挥着重要作用。在低温、干旱、高浓度Na Cl和厌氧条件下,可以促使VP基因的表达,维持细胞内部平衡,可以提高植物的抗逆能力。本研究对棉花基因组中VP基因家族成员进行了系统分析,利用雷蒙德氏棉、亚洲棉(石系亚1号)和陆地棉(中9807、中s9612、中9409、GK50、Y2067和GZ)为实验材料,对VP基因各家族成员进行克隆,并根据盐胁迫(0.4%)后各基因成员的表达量变化和转基因种子的耐盐性萌发能力对VP基因进行功能分析,主要研究结果如下:1.比较系统的分析了棉花A、D基因组中的VP基因家族成员。利用棉属二倍体雷蒙德氏棉(D组)和亚洲棉(A组)基因组信息,以Gh VP(Gene Bank No.:ADN96173.1)序列为参考序列,共鉴定出13个VP基因成员,其中A组6个(Ga VP1-Ga VP6),D组7个(Gr VP7-Gr VP13),是一类在植物进化中相对比较保守的家族。2.分析了VP基因家族的进化关系。从进化树分析可知,同一物种内的VP基因序列相似性较高,亲缘关系也相对较近;基因结构分析结果显示,大部分VP基因的外显子数量都为7-8个,少数VP基因的外显子数量差异较大,1-14个不等;对保守结构域分析可知,VP基因成员都具有多个相对保守的结构域,如肉豆蔻基化位点,酪蛋白激酶位点Ⅱ,蛋白激酶磷酸化位点等,为进一步研究棉花中VP基因的功能提供了重要依据。3.研究了VP基因家族的表达水平。荧光定量结果表明,VP基因成员在不同组织中的表达水平不同,其中在叶片中表达水平最高,纤维中的表达水平最低,存在组织特异性。而且随着盐胁迫强度的增加,VP家族中不同成员的表达水平发生变化不同。4.克隆了棉花GhVP基因。构建pBI121-Gh VP::GFP荧光表达载体,采用基因枪技术转化洋葱内表皮细胞,结果显示Gh VP基因定位于细胞质膜上。构建p BI121-Gh VP::GFP荧光表达载体转化棉花花粉,花粉荧光明显增强,说明p BI121-Gh VP::GFP基因可以在棉花中表达,为Gh VP基因在棉花中表达提供依据。5.研究了Gh VP和Gh NHX基因在棉花上的表达。构建了荧光表达载体p BI121-Gh VP::GFP,超表达载体p BI121-Gh VP::NHX,和p BI121-PH::VP干扰载体并用基因枪活体转化技术成功转化棉花,种子耐盐性检测发现VP基因与棉花耐盐性相关,可提高棉花耐盐性。本研究通过对焦磷酸酶基因VP的家族的鉴定和表达差异分析,以及转基因耐盐性检测,为进一步研究棉花焦磷酸酶基因VP耐盐机制奠定了基础。


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