银纳米颗粒和iLOV蛋白之间的相互作用

【摘要】：能量转移和电子转移在许多物理、化学、生物过程中起着重要的作用。相比于块状材料,纳米颗粒由于其独特的物理、化学特性而被广泛的研究,同时,这些特性使得纳米颗粒在很多领域得到广泛的应用,例如,光学、电子、生物、医学等等,因此,研究者对金属纳米颗粒与蛋白之间的相互作用、探究生物过程机制以及开发其在生物、医学等领域的应用给予了很多的关注,包括生物传感、基因治疗、生物成像、药物识别等等。本文以银纳米颗粒和iLOV蛋白为研究对象,利用稳态及瞬态荧光光谱等技术深入研究了两者之间相互作用的过程以及影响这个过程的因素和机制。本文由以下的几个部分组成:1.银纳米颗粒的制备:利用凝胶溶胶法制备出了银纳米颗粒,通过改变温度获得到粒径分别为67 nm、29 nm和15 nm的三种银纳米颗粒,并利用吸收光谱和动态光散射的手段对其进行了表征。2.蛋白的纯化:通过一系列操作纯化出目的蛋白,并对目的蛋白的吸收、荧光、寿命等光学性质进行了表征。根据iLOV蛋白的氨基酸序列预测出目的蛋白的分子量为13kD,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法对目的蛋白进行表征,确认了iLOV蛋白的结构和功能,所得的结果与文献报道的iLOV蛋白特性一致。3.银纳米颗粒与iLOV蛋白之间相互作用的研究:利用iLOV蛋白的荧光特性,通过逐渐向iLOV蛋白中加入少量银纳米颗粒,发现iLOV蛋白的荧光强度随着银纳米颗粒的加入逐渐减小;随着Ag纳米颗粒的增加,iLOV蛋白的荧光寿命也逐渐减小,证实两者之间存在着相互作用。为了进一步研究二者之间的相互作用,分别研究了iLOV蛋白与不同粒径银纳米颗粒之间的作用过程,发现在67 nm、29 nm、15 nm三种粒径存在的情况下,iLOV蛋白的荧光都有不同程度的强度淬灭和荧光寿命的减小,且荧光淬灭程度随银颗粒尺寸的增加逐渐增强4.银纳米颗粒淬灭iLOV荧光的机制:金属纳米颗粒表面的荧光淬灭可能来自于荧光共振能量转移(FRET)、电子转移或表面能量转移。通过分析,排除了二者之间发生FRET的可能性;运用表面能量转移公式计算出的这一体系的能量转移效率的理论值和实际值,排除了表面能量转移的可能性;确定了银纳米颗粒淬灭iLOV蛋白荧光的主要通道是两者之间发生电子转移;通过动力学分析,进一步确定了不同尺寸银纳米颗粒与iLOV蛋白之间电子转移的速率。5.确定电子转移路径:根据iLOV蛋白的氨基酸序列,83位存在一个色氨酸,可能在电子转移的过程中起着中间媒介作用。通过点突变、表达和纯化获得并确定了iLOV-W83A对照蛋白。结果发现,iLOV-W83A在银纳米颗粒存在的情况下,其荧光寿命并没有发生变化,也与银颗粒的大小无关。证实了iLOV与银纳米颗粒之间存在电子转移,而且是由83位的色氨酸实现的。综上,本文利用稳态和瞬态荧光光谱技术系统研究了不同尺寸的银纳米颗粒与iLOV荧光蛋白之间的相互作用,观察到银纳米颗粒对iLOV荧光蛋白的淬灭现象,分析并确定了电子转移是二者之间相互作用的主要机制,并与银颗粒尺寸之间存在一定的依赖关系;通过点突变及相关的对照实验,确定了二者之间的电子转移是由色氨酸介递,证实了LOV蛋白的光响应特性和功能是由83位色氨酸残基的光诱导电子转移实现的。研究结果对于揭示LOV蛋白的功能及在生物分子传感器、纳米光子学及分子成像技术等方面具有一定的科学意义。