桂花花瓣的类胡萝卜素代谢途径及其调控研究

【摘要】：桂花(Osmanthus fragrans Lour.),为木犀科木犀属植物,原产我国,在我国有着长达2500年的栽培历史,是著名的园林绿化植物、芳香树种,是我国的传统名花。桂花因其特有的芳香和美好的寓意深受人们喜爱,在食品、药材、香料等方面都有很大的开发和应用价值。桂花分为:金桂、银桂、丹桂和四季桂4个品种群。桂花花瓣类胡萝卜素的含量决定了桂花花色,花瓣中类胡萝卜素的含量越高,花瓣的颜色就会越深。桂花中的类胡萝卜素经过催化裂解可以产生芳香类物质,使桂花产生特有的香气。本实验通过分子生物学和生理生化的方法研究桂花花瓣中类胡萝卜素代谢途径及相关基因的调控。为以后能优化桂花花色、更加有效的利用桂花花香和培育更多的新品种提供了理论依据。本实验以丹桂品种‘橙红丹桂’和银桂品种‘白洁’盛花期花瓣为主要实验材料,研究桂花花瓣的类胡萝卜素代谢途径,主要研究内容及结果如下:1.银桂和丹桂盛花期花瓣中类胡萝卜素和芳香成分含量分析利用气相色谱-质谱联用技术(GC/MS)对银桂和丹桂盛花期花瓣的芳香成分分析,结果表明,在银桂和丹桂花瓣中均鉴定出29种芳香成分,其中银桂中β-紫罗酮的含量相对较高,占总挥发油成份的35.59%,丹桂中的主要成分是芳樟醇,占总挥发油成份的33.95%。桂花花瓣中芳香成分的种类和含量的不同导致不同品种桂花的香味有所差异。通过高效液相色谱技术(HPLC)分析银桂和丹桂花瓣中的类胡萝卜素含量。结果显示花色较浅的银桂花瓣(淡黄色)中仅含有少量的β-胡萝卜素,花色较深的丹桂花瓣(橙红色)中含有丰富的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素。因此花瓣中类胡萝卜素的种类和含量的不同是导致银桂与丹桂品种花色差异的主要原因。2.类胡萝卜素代谢途径相关基因表达的定量PCR分析通过荧光定量PCR实验技术,分析类胡萝卜素代谢途径相关基因在银桂和丹桂花瓣中表达量的差异。结果显示,OfPSY、OfZDS、OfLCYE、OfHYB、OfPDS、OfLCYB、OfCCD1基因在丹桂中的表达量均高于银桂,OfZEP、OfCCD4基因在丹桂中的表达量明显低于银桂,基因表达量的差异使得银桂花瓣中仅存在少量的类胡萝卜素,花瓣呈浅黄色,丹桂中积累了丰富的类胡萝卜素,花瓣呈橙红色。银桂和丹桂中基因的差异性表达决定了不同品种的桂花花瓣颜色的差异。3.MYC2转录因子的序列分析及其与CCD4基因的RT-PCR结果利用特异性引物克隆OfMYC2基因的全长。该基因编码区长2028 bp,编码676个氨基酸。Blast分析显示,该基因含有MYC结构域,桂花MYC2蛋白与油橄榄(O.europaea)、芝麻(S.indicum)、丹参(S.miltiorrhiza)有较近的亲缘关系,该转录因子与油橄榄(O.europaea)的MYC2、烟草(N.tabacum)的MYC2等序列同源性较高。RT-PCR分析结果表明,OfMYC2在银桂和丹桂不同花期的表达模式与OfCCD4基因的表达模式基本一致,该基因可能参与了OfCCD4基因表达的调控。4.MYC2转录因子转录激活活性验证构建重组质粒pLacZi-HLH和PJG-MYC2,将其共转化入酵母感受态细胞内,同时共转化质粒PJG和重组质粒pLacZi-HLH作为对照组。经培养,用Z-buffer/X-gal染色液染色后发现,共转化重组质粒PJG-MYC2和pLacZi-HLH的菌落在30 min内显蓝色,对照组没有显蓝色。实验结果显示,OfMYC2转录因子能够与桂花CCD4启动子区域的HLH元件特异性结合,OfMYC2转录因子有转录激活功能,可能参与了OfCCD4基因表达的调控。5.MYC2转录因子的原核蛋白表达构建原核蛋白表达载体pEASY-MYC2,将重组载体转入大肠杆菌感受态BL21中,通过培养和诱导表达获得蛋白。利用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶,经过电泳、染色、脱色,观察到73 KD大小的OfMYC2蛋白目的条带。