透明质酸螯合siRNA的纳米药物用于脑胶质瘤的高效治疗

【摘要】：利用小分子干扰RNA(siRNA)抑制特定基因活性的RNA干扰(RNAi)技术是治疗癌症的一种新型治疗方式。然而,siRNA分子的靶向递送仍然是临床转化和实际应用中的巨大挑战之一。迄今为止,用于输送siRNA的纳米载体主要有阳离子聚合物、阳离子脂质体和阳离子无机纳米粒子。强阳离子材料能够通过静电相互作用与siRNA复合形成纳米颗粒,进而保护siRNA避免RNase酶降解,然而强阳离子材料对细胞/组织毒副作用大,由此可见开发出一种安全高效的弱阳离子siRNA递送载体对癌症的治疗具有潜在的应用前景。本论文设计了一种生物还原性、弱阳离子的siRNA递送载体。它由透明质酸(HA)作为基本骨架,再通过具有还原敏感功能的二硫键(-SS-)将二甲基吡啶胺(DPA)接枝到HA上而得到。HA-SS-DPA在锌离子存在下能通过配位螯合选择性地与siRNA复合形成稳定的siRNA纳米药物。此纳米药物被细胞摄取后,可通过肿瘤细胞质内大量的还原物质谷胱甘肽(GSH)刺激释放siRNA,以达到RNAi特异治疗的效果。本论文主要研究了这种新型siRNA纳米药物的生物物理特性、还原响应性、细胞内吞、药代动力学、体内外的基因沉默以及在异种移植胶质母细胞瘤肿瘤模型的治疗效果。首先本论文系统地研究了三种不同取代度的HA-SS-DPA聚合物与siRNA自组装形成纳米粒子及其体外生物物理特性。⑴聚合物HA-SS-DPA在锌离子存在下与siRNA在质量比为40/1,30/1,20/1和10/1条件下自组装,形成的粒径大小为136 nm~233 nm;⑵纳米药物体外还原响应评估结果表明,HA-SS-DPA(Zn)/siRNA在10 mM二硫苏糖醇(DTT)处理24 h后,包裹的siRNA全部被释放,证明此纳米药物具有还原响应性;⑶透射电子显微镜(TEM)清晰地观察到纳米颗粒呈球形且形态均一,检测到平均粒径为100 nm左右。其次本论文研究了HA-SS-DPA(Zn)/siRNA纳米药物在人神经胶质瘤U87MG细胞水平上的细胞毒性、细胞内吞和基因沉默等实验。⑴通过HA-SS-DPA(Zn)/siRNA与U87MG细胞共孵育的细胞毒性实验结果显示,其细胞存活率为92.1%~99.6%,表明本纳米药物对细胞基本无毒性,展现出良好的生物相容性;⑵共聚焦显微镜(CLSM)定性分析了siRNA纳米药物被U87细胞内吞及释放的能力,结果表明HA-SS-DPA(Zn)/siRNA纳米药物可被U87高效内吞,并随着DPA接枝度的增加而增加。流式细胞定量分析实验也进一步证实了该结论;⑶荧光素酶RNA干扰实验结果表明,HA-SS-DPA(Zn)/siRNA具有良好的基因沉默效率,最高可达48%。最后本论文在动物水平研究了HA-SS-DPA(Zn)/siRNA纳米药物的药代动力学、基因沉默、生物分布以及肿瘤治疗效果。⑴药代动力学结果表明,在HA-SS-DPA载体的协助下,siRNA的血液循环时间半衰期为34.7 min,显著性高于游离的siRNA(为1.6min);⑵体内的基因沉默实验显示,HA-SS-DPA(Zn)/siRNA的基因沉默效果高达48%,这与体外细胞水平的基因沉默效果基本一致;⑶HA-SS-DPA(Zn)/siRNA应用于U87MG皮下荷瘤小鼠模型时,siRNA纳米药物在体内的分布主要集中在肿瘤部位,在其他组织富集量相对较少,游离siRNA主要分布在肾脏和肝脏;⑷肿瘤抑制生长实验针对Polo样激酶-1(PLK1)为靶点进行评估。实验结果均表明,HA-SS-DPA(Zn)/siRNA能有效的抑制肿瘤的生长;⑸组织学分析结果表明,HA-SS-DPA(Zn)/siRNA在肿瘤组织中诱导细胞大面积坏死及凋亡,而对心、肝、脾、肺和肾的损伤很小,这证实了HA-SS-DPA(Zn)/siRNA具有较高的肿瘤选择性和较低的副作用。本论文实验结果表明构建的新型siRNA递送载体,能合理解决siRNA现阶段在体内所面临的半衰期短、难以进入肿瘤细胞内、难以被肿瘤细胞选择性摄取和药物在病灶部位释放缓慢等诸多重要问题,增强了siRNA的治疗效果。同时,由于HA-SS-DPA具有良好的生物相容性,使其在癌症的RNAi治疗上具有潜在的临床应用前景。