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重组大鼠白细胞介素18(rrIL-18)的毕赤酵母表达及其对大鼠肝细胞和肿瘤细胞的作用研究

孙冬冬  
【摘要】:白细胞介素18(IL-l8)又称IFN-γ诱导因子(IGIF),是上世纪90年代发现的一种细胞因子,主要由活化的巨噬细胞产生。IL-18能够诱导Thl、NK、T细胞产生IFN-γ,具有抗肿瘤、抗病原微生物以及抗超敏反应等生物学功能,另外IL-l8还与I型糖尿病、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病有关。由此可见,IL-18具有多种生物学功能并且有潜在的临床应用价值。本文研究了大鼠白细胞介素18在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达,并摸索了重组大鼠IL-18的纯化工艺,以及rrIL-18对大鼠肝细胞的增殖作用研究。 本文研究不同载体-菌株组合对rrIL-18表达水平的影响时发现:在表达rrIL-18时,pPICZα系列载体作为表达载体要优于pPIC9系列表达载体;而选用X-33菌株的rrIL-18表达水平要优于GS115菌株,说明选用X-33作为宿主菌有利于提高rrIL-18的表达量。 本文研究3L发酵罐规模下不同因素对rrIL-18表达水平的影响时发现,不同的起始诱导密度、溶解氧体积分数(DO)、pH、温度、甲醇浓度以及甘油添加量等培养条件对rrIL-18表达水平均有影响。最佳表达条件为一级种子以10%的接种量接入基础盐培养基中,起始诱导密度为750,发酵过程中保持DO在20%,诱导温度22℃,pH=5.75,甲醇电极控制甲醇浓度在0.25%,诱导过程中添加甘油2g/(L·h),发酵全过程由发酵罐控制系统进行在线控制和数据采集。最佳表达条件下,诱导144h后rrIL-18表达量接近0.35g/L。 本文摸索了分离纯化rrIL-18的条件,结果表明,运用超滤、等电点沉淀、乙醇沉淀以及疏水层析依次对rrIL-18的3L发酵液进行分离纯化,可获得纯度90%左右的目的产物。 本文初步检测了rrIL-18对大鼠肝细胞生长增殖作用,BrdU免疫荧光法测得结果发现rrIL-18对大鼠肝细胞有增殖作用,其增殖作用随浓度的升高而增强;但当其浓度超过一定值后对肝细胞的增殖作用不明显。从而为进一步搞清rrIL-18的其它生物学作用奠定了基础。


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