一株降解石蜡菌株的分离鉴定及其表面活性剂的研究

【摘要】：油田含蜡量较高,且多数为长碳链蜡分子,造成十分严重的结蜡现象,给采油带来严重影响,所以采取措施进行清防蜡是非常有必要的。通常采用热水、热油进行洗井清蜡,或使用化学清防蜡剂进行清防蜡。但这些措施工作量都大、且费用高,化学清防蜡剂会降低原油质量、对环境造成破坏、以及威胁工人的健康;热水洗井会引起地层粘土膨胀造成采油堵塞;而长期进行热油洗井,则会对油井的结构造成损坏。本文由此立题,从青海油田表层取回油水混合物样品,经过分离、纯化得到一株菌,通过16SrDNA基因的测序,确定其系统分类学地位;并了解该菌株的生理生化特性;由于该菌株生长速度慢,需要确定该菌株的最适生长条件,进而对菌株的培养条件进行优化;接着在石蜡降解过程中,探究了该菌株的最佳降蜡条件,但降解石蜡的效果不高,所以为了获得高降解能力的菌株,本实验利用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)进行诱变育种,获得了高降蜡能力和高稳定性的突变菌株Y7;且在培养过程中该菌株表现出一定的乳化性,表明该菌株能够产生表面活性物质——具有重要活性的次级代谢产物,又对该菌株所产生的生物表面活性剂进行了初步研究。主要研究结论包括以下几个方面:(1)在样品中分离、纯化、并且经过16SrDNA测序,确定了本实验得到的菌株是印度洋深海食烷菌(Alcanivorax dieselolei),它属于Proteobacteria变形杆菌门,Gammaproteobacteria变形杆菌纲,Oceanospirillales海洋螺菌目,Alcanivoracaceae烷烃降解菌科,Alcanivorax食烷菌属;且为革兰氏阴性菌,不产芽孢。(2)该菌株的最佳发酵条件为:装液量为60 m L/250 m L,初始pH值7.0,温度33℃,转速150 rpm,发酵时长7 d;营养物质配方NaCl浓度30.0 g/L,K_2HPO_4 2.0 g/L,MgSO_4浓度0.4 g/L,氮源为蛋白胨,碳源为植物油。优化后的菌体数量最高达到3.688×1011个/m L,比优化前数量上提高105倍。该实验证明了菌株在优化后的培养条件下生长,菌体数量显著上升。(3)该菌株的最佳降蜡条件为:在石蜡液体培养基、初始石蜡浓度为20.00 g/L、处理时间9 d、摇床转速180 rpm、MgSO_4、K_2HPO_4、Fe Cl3的浓度分别在0.80 g/L;3.00g/L;0.05 g/L、葡萄糖含量12.00 g/L、培养温度33℃、培养基初始pH值为8.0、以及最佳NaCl浓度15.00 g/L时,降解石蜡的能力最好,可达到58.87%。(4)ARTP诱变处理该菌株,时间为30 s时更容易出现高降解石蜡的菌株。该操作在高纯氦气作为工作气体的条件下,工作功率为120W,气体流量10 SLM,待处理样品与等离子体发生器射流出口间距设定为2 mm,减压阀低压输出端压力在0.1~0.15MPa。经诱变以后,最终得到一株具有较高降蜡活性的诱变菌株Y7。在优化后的降解石蜡条件下,该诱变菌株降解石蜡的能力较出发菌株提高了51.49%,达到89.05%。(5)突变菌株Y7具有很好的遗传稳定性,连续传6代,每一代的降解石蜡能力都稳定在80%以上。(6)该菌株产生的次级代谢产物——生物表面活性剂,研究表明:该生物表面活性剂存在于细胞外,乳化性和稳定性良好,该表面活性剂是属离子型,归属于脂肽类活性物质。