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受茶尺蠖取食诱导茶树基因的克隆

乔金莲  
【摘要】: 茶树(Camellia sinensis)是一种特殊的经济作物,茶尺蠖(Ectropis oblique Prout)是茶树的主要害虫之一。茶尺蠖以咀嚼方式咬食茶树的叶片,吸取叶片中的大量汁液作为其营养源,给茶树的生长发育造成危害。深入了解茶尺蠖为害茶树和茶树对虫害反应的机理,是有效利用茶树抗性、提高茶尺蠖综合防治效果的基础。国内外科学家有关植物对植食性昆虫取食诱导防御的分子机制研究,主要集中于拟南芥、烟草、玉米和豆科等一年生草本植物。这些植物体内成分相对简单,生育周期短,而茶树属多年生木本植物,体内此生代谢途径多样,成分复杂,富含酚类、生物碱、芳香物质和皂甙等化合物,体内抗虫资源丰富。我国有关害虫对茶树的防御机制研究主要集中在诱导产物的分离、鉴定及其对天敌的影响等生化层面,如目前已鉴定出这些化合物的主要成分属于吲哚、萜类、醇类和醛类,而有关害虫诱导防御中的分子机制至今还未见报道。本文选用信阳毛尖‘信阳大叶’为材料,对茶树抗虫反应中基因表达的调控进行了研究,主要结果如下: 1.构建了茶尺蠖取食后‘信阳大叶’的抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)文库。以茶尺蠖取食5h的‘信阳大叶’cDNA作为Tester,与未被茶尺蠖取食的‘信阳大叶’cDNA作为Driver,利用抑制性差减杂交技术,构建了茶尺蠖取食诱导的茶树叶片差减cDNA文库。 2.从茶尺蠖取食诱导茶树叶片相关基因的差减cDNA文库中,随机挑选420个克隆,通过PCR和斑点杂交两轮筛选,得到28个cDNA片段。通过荧光定量RT-PCR分析,分离出19个受茶尺蠖取食诱导的基因,其中包括参与脂类代谢的基因、编码细胞壁蛋白的基因、木质素合成基因、类黄酮合成代谢基因和转录因子等。13-脂氧合酶(13-lipoxygenase,13-LOX)基因和ω-3脂肪酸去饱和酶基因的分离表明茉莉酸是调控茶树抗虫反应的重要信号分子。茶尺蠖的取食诱导多个茶树类黄酮合成途径基因的表达,说明类黄酮类物质,尤其是缩合丹宁,是茶树防卫系统的重要组成部分。细胞壁是植物抵御不良环境的第一道屏障,茶尺蠖取食时,细胞壁蛋白基因和木质素合成途径基因的表达水平升高,表明在植物应对咀嚼式口器昆虫取食中发挥重要作用。 3.利用RACE技术,从茶叶中克隆了rd22基因的全长cDNA序列。测序后的结果分析表明,该cDNA序列全长为1293 bp,5′非翻译区为15 bp,3′非翻译区为263 bp,开放读码框为1014 bp,编码337个氨基酸。在氨基酸序列的C端含有一个比较保守的BURP结构域。信号肽检测证明该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸区域为信号肽结构。


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