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魔芋软腐病病原菌及其拮抗菌的研究

吴金平  
【摘要】:魔芋(Amorphophallus konjac)为多年生草本植物,主要分布在东南亚和非洲。它是世界上迄今为止发现的唯一高含葡苷聚糖的植物。魔芋葡苷聚糖(konjac glucomannan, KGM)具有许多独特的理化性质,是食品工业、医药工业、化学工业、石油钻探、建筑业、农业等方面的重要原料。随着全球魔芋产品需求量日益增加,作为传统生产大国的日本魔芋种植业却因为土地和人口老龄化等问题的困扰而逐渐衰落,这为中国魔芋产业发展带来了前所未有的契机。但随着我国魔芋种植面积的不断扩大,其病害也越来越严重,尤其是软腐病严重时可以导致绝收。魔芋软腐病属系统性侵染病害,主要通过带病的种芋和土壤传播,至今还没有一种有效的方法来控制该病害。本文通过魔芋软腐病病原菌遗传多样性的研究,利用分子诊断技术鉴定种芋带菌量及其种类,初步研究软腐病病原菌的侵染路径,以及魔芋软腐病菌的拮抗菌筛选和新的软腐病病原菌的发现,为魔芋软腐病的防治和抗病育种提供理论依据、方法及资源材料。通过研究取得了以下主要结果: (1)收集各地魔芋软腐病病原菌33份,分别进行形态学观察、常规生理生化测定、病原菌回接鉴定、16S rDNA的序列测定及系统发育树构建和分析。结果表明魔芋软腐病病原菌为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovora subsp. carotovora, P. c. c.)和菊果胶杆菌(Pectobacterium chrysanthemi, P. ch),其主要致病菌为P.ch,且同一地区存在两种病原菌并存的现象。从构建的系统发育树可以看出,P.c.c.与P.CH明显分为两支;而且p.c.c.与p.ch曲内部的遗传多样性较丰富,遗传上没有出现明显的地理分化。 (2)利用已知软腐病菌的16S rDNA序列,设计3对特异引物:一对引物用于荧光定量PCR检测软腐病(F/R:ATGCAACGCGAAGATCCTTAGGTAC/CATTGAAGCACG TGTCTAGCCCTAC);另外针对魔芋软腐病的两个致病种P.c.c.和P.ch分别设计了两对特异引物(C1/C2:ATGCAACGCGAAGATCCTTAGGTAC/CATTGAAGCACGTGTCTAGCC CTAC; H1/H2:CCTGAGTTCCCACCCGTAGTT/GCGAAGACTGCAGAGATGCCG)。通过优化荧光定量PCR及ARMS-PCR的反应条件,荧光定量PCR可以定量检测到1个软腐病病原菌,比常规PCR灵敏100倍;而针对P.c.c.和Pch的ARMS-PCR方法能直接、快速、精确的鉴定P.c.c.和P.ch.,与传统的鉴定方式如致病性、理化性质和表型特征分析等相比更为简便。 (3)在软腐病原菌侵染路径的研究中发现,底部2/3浸泡软腐菌液的魔芋球茎在开始生长阶段无软腐症状,只有等根系长出,才通过根系侵染球茎;而软腐病原菌接种芽鞘、根和伤口后24h就表现软腐症状,以上结果说明软腐病原菌不能直接侵染球茎,但可以侵染芽鞘、根和伤口。扫描电镜观察发现球茎表面无气孔也无皮孔,表明魔芋软腐病原菌浸染途径与土豆软腐病从皮孔侵入不同;同时,感病芽鞘气孔周围没有病原菌聚集,推测魔芋软腐病原菌与魔芋表皮的气孔之间可能存在生理不亲和反应,与软腐病病原菌不能通过大白菜表皮的气孔侵染的机理类似。通过宏观和微观研究,从侵染的部位而言,首次证实魔芋软腐病原菌不能直接侵染完好无损的魔芋球茎,但可以侵染根、芽鞘等;从具体侵入点而言,自然孔口不是其特异的侵入点,而在有伤口存在的情况下,伤口是最为主要的侵入点。 (4)从感软腐病魔芋样本的病健交界处筛选到一株对魔芋软腐病菌有较强抑菌作用的拮抗菌。通过形态学观察、常规生理生化测定、16S rDNA的PCR扩增和序列分析,初步确定本研究得到的拮抗菌为黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。测定了该菌的发酵最适pH、碳源和氮源,并对其所产生的抗菌物质做了初步的分离与分析。但关于拮抗物质是否为新的抗菌物质、物质分子结构、特性如何等还待进一步深入研究。 (5)分离了一株新的魔芋软腐病病原菌。通过形态学观察、常规生理生化测定、16S rDNA的PCR扩增和序列分析,初步确定为肠杆菌科细菌(Enterobacter.SP)。但关于该病菌侵染魔芋途径及侵染后在魔芋体内的定殖方式等有待进一步研究。


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