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大分子拥挤环境中朊蛋白错误折叠机制研究

周拯  
【摘要】:蛋白质是生物体最重要的组成成分,一旦蛋白质形成了错误的空间结构,直接导致其生物学功能的丧失或改变,继而引起众多相关疾病,迄今已发现有二十多种蛋白质的错误折叠与疾病相关。传染性海绵样脑病(Transmissible spongiform encephalopathies, TSEs)即所谓prion疾病(prion diseases)是一类慢性的、可在多种哺乳动物之间广泛传播的致死性中枢神经系统疾病。兔是少数几种对TSE感染因子具有抗性的哺乳动物之一。细胞型朊蛋白错误折叠形成致病型朊蛋白发生在拥挤的细胞外膜环境中,而致病型朊蛋白是引起TSEs的关键感染因子。本文以人朊蛋白、兔朊蛋白及它们的突变体蛋白为研究对象,利用多糖拥挤试剂模拟拥挤的细胞外膜环境,运用生物物理学手段,研究了模拟生理环境中两种朊蛋白错误折叠与聚集的动力学和二级结构变化规律,并观察其形成淀粉样纤维程度及形态的差别,进而探讨细胞外膜生理环境在人/兔朊蛋白错误折叠中的促进/抑制作用及其内在机制。 第一部分的实验结果表明大分子拥挤试剂显著促进了人朊蛋白淀粉样纤维的形成。利用Sigmoidal equation拟合得到的成核延滞期时间与延伸期的表观速率常数表明:类细胞的大分子拥挤环境对人朊蛋白淀粉样纤维化过程的成核期有显著的促进作用。此外,大分子拥挤环境使得人朊蛋白形成更短的纤维及颗粒,且相对稀溶液中形成的纤维具用更弱的结构稳定性和更强的蛋白酶K抗性。以上种种表明,一方面大分子拥挤环境加速了人朊蛋白错误折叠纤维化的进程;另一方面,大分子拥挤环境促进了人朊蛋白纤维的片段化并改变了纤维的构象稳定性及酶解抗性,这可能对于朊病毒感染及复制有重要意义。 对于兔朊蛋白的淀粉样纤维化过程,大分子拥挤环境则表现出不一样的影响。低浓度大分子拥挤试剂的存在对于兔朊蛋白淀粉样纤维生长有一定程度的促进,但随大分子拥挤试剂浓度进一步升高,兔朊蛋白淀粉样纤维的形成受到显著抑制。以透射电镜观察不同浓度大分子拥挤试剂存在条件下兔朊蛋白纤维化可以发现,高浓度的大分子拥挤试剂将兔朊蛋白淀粉样纤维生长的进程停滞于类似于寡聚体或原纤维的阶段,从而抑制了淀粉样纤维的进一步生长。 在此基础上,我们比对了人与兔朊蛋白一级结构序列,根据相关文献确定了可能影响纤维化过程的关键氨基酸残基,利用分子生物学方法突变并表达得到了人及兔的相关位点突变体蛋白质。进而研究了这些突变体在稀溶液及大分子拥挤试剂存在条件下淀粉样纤维形成过程。初步的实验结果表明兔朊蛋白三点突变(S173N/L137I/G99N)在稀溶液中的纤维化动力学与野生型相近,但大分子拥挤试剂的存在显著缩短了延滞期并促进了延伸速率;而人朊蛋白突变体(N174S/I138L/N100G)随着突变位点的增加,其在稀溶液中淀粉样纤维形成的延滞期显著增长,但最终平台都能达到相近的ThT值,大分子拥挤试剂存在时同样在一定程度上促进了淀粉样纤维的形成,但对于延滞期和延伸速率的促进作用相对于野生型则相对较低。以透射电子显微镜观察人或兔朊蛋白突变体淀粉样纤维的形态可以发现,相对于野生型朊蛋白,其形态学并没有发生显著变化。由目前的结果可以推测,兔朊蛋白在引入上述三个位点的突变后可能引发其转向类似于人朊蛋白的错误折叠方向,而人朊蛋白的对应突变体则只在一定程度上延迟了纤维化进程,仅此三个位点的突变并不能逆转大分子拥挤试剂对人朊蛋白的纤维化进程的影响。


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