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乙肝病毒耐药及致癌突变的高灵敏检测新技术研究

唐景峰  
【摘要】:本课题基于HBV耐药及致癌基因点突变所建立一种快速、多重、阵列化、超灵敏的鉴别检测新技术。该技术以荧光定量PCR为平台,以96孔板为阵列并划分若干模块,利用AllgloTM探针及其特制荧光基团(MAR、JUP、SAT、PLU、NEP、URA)对LAM耐药位点(rtL180M、rtM204I/V)、ADV耐药位点(rtA181V/T、rtN236T)及致癌突变位点(A1762T/G1764A)进行同步、鉴别、定量检测。此技术可以有效区分野生株、突变株及野生/突变混合株,具有灵敏性高、特异性强、操作简单、高通量等特点。以此为平台技术,可以延伸到其它病毒耐药及致癌突变,实现高效、准确、灵敏检测,为临床诊断和个性化治疗起到辅助作用。 本课题分别构建了HBV LAM rt180L(野生株)、rt180M(突变株)、rt204M(野生株)、rt204I/V(突变株);ADV rt181A(野生株)、rt181V/T(突变株)、rt236N(野生株)、rt236T(突变株);HBV BCP区1762A/1764G(野生株)、1762T/1764A(突变株)的重组质粒。以上述质粒为标准品,针对每个阵列模块建立了基于LAM、ADV耐药突变及BCP区点突变的多重荧光定量方法,对阵列模块式多重荧光定量方法的灵敏性、特异性、精密度及稳定性进行了分析与评价。结果显示,本实验所建立的阵列模块式多重荧光定量方法对HBV LAM、ADV及HBV BCP区突变的检测限均在1×102 copies/ml以下,野生株和突变株混合试验均表现出高特异性,精密度范围在1.1%-2.2%之间,37℃2h加速破坏试验(注:37℃放置2h相当于-20℃6个月)各项数据指标均较好。综上所述,本实验建立的阵列模块式多重荧光定量方法可以有效区分单个碱基的突变,并且可以同步区分野生株、突变株及野生株/突变株混合型。同时,在所建方法标准曲线的标定下,还可以对各个突变位点的突变率进行初步定量,以此为临床医生提供诊疗参考。 利用此项技术分别对245例样本(115+130+60)进行了检测,115例样本(其中LAM治疗过程中出现表型耐药的HBV样本20例)针对LAM耐药进行了检测,结果发现rtL180M位点突变有11例,rtM204I(YIDD)突变有14例,rtM204V(YVDD)突变有7例,rtL180M/rtM204I(YIDD)突变有4例,rtL180M/rtM204V(YVDD)3例,rtL180M rtM204I (YIDD)/rtM204V (YVDD)2例,突变率分别为9.57%,12.17%、6.09%、3.47%、2.61%及0.86%。130例样本(其中ADV疑似耐药样本10例)针对ADV耐药进行检测,结果发现rt A181V位点突变5例,rtA181T位点突变6例,rtN236T位点突变3例。rt A181V/T与rtN236T位点突变1例,突变率分别为3.85%、4.62%、2.31%及1.74%。60例乙型肝炎样本(其中肝癌样本15例)针对BCP区1A1762T/G1764A位点进行突变检测,结果发现A1762T/G1764A位点双突变有9例。同时,对上述245例样本用基因测序法进行平行检测,结果除LAM rtL180M突变有1例不一致之外,其余位点突变结果均一致。 由此可见,本课题所建立的模块化、多重荧光定量点突变检测方法灵敏度高、特异性强,适用与野生株和突变株的混合感染,解决了传统方法区分度差、灵敏性低的问题,能更好的适用于医院对HBV耐药及肿瘤的早期诊断,为患者早诊断、早发现、早治疗起到了很好的帮助,也为医生临床用药及对症治疗赢得了时间。


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