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重组人腺病毒p53联合盐酸表阿霉素抑制人胃癌细胞SGC-7901的实验研究

谢忆山  
【摘要】:研究背景和目的:胃癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,并且其中有42%的胃癌发生在中国,根据2004至2005年的一项调查显示,胃癌是中国全部癌症死亡的第三大死因。早期胃癌通过根治性切除可以治愈,然而15%至50%甚至更多的胃癌患者在手术探查的过程中发现腹膜转移,这类病人不再适宜进行根治性切除。更为不利的情况是,很久以来人们认识到胃癌总体而言对传统的细胞毒类化疗药物并不敏感。随着肿瘤基因组学的发展,基因治疗成为一种很有前景的胃癌综合治疗方案。 肿瘤抑制基因p53位于染色体17p13,是人类肿瘤中最常见的突变基因。正常的p53基因即野生型p53基因,其功能是调节细胞周期、DNA降解以及细胞凋亡。突变型p52基因这些功能发生缺陷,从而导致细胞恶变。据报道有60%的人类胃癌发生p53基因突变。 今又生(重组人腺病毒p53注射液,rAdp53,深圳百赛诺基因技术有限公司,中国深圳市)是全球首个商业化应用的基因治疗产品,首先应用于头颈部肿瘤的治疗,随后应用与其它恶性肿瘤的治疗。今又生以修饰过的血清5型腺病毒作为载体来表达p53基因,在细胞核和细胞浆内激活凋亡通路诱导细胞凋亡。今又生还能通过一种旁路效应来增强细胞对药物的敏感性。据报道今又生在头颈部鳞癌(HNSCC)、肺癌、乳腺癌和肝癌患者治疗中显示出一定疗效并且患者耐受性良好。虽然初步结果令人鼓舞,但是人们认识到单独应用基因治疗肿瘤目前还不能寄予很高的期望,基因治疗联合应用其它治疗手段例如化疗也许能产生更多的治疗收益。因此,本研究设计通过体外与体内试验,旨在探讨重组人腺病毒p53单独应用、或者与化疗药物联合应用,在胃癌治疗中的潜在可能性。 方法:(1)人胃腺癌细胞系SGC-7901培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中,37℃、5% CO2、饱和湿度培养。将SGC-7901细胞以3.6x104/孔接种于24孔培养板中,四个治疗组分别加入109 vp rAdp53、1μg EPI、联合两药(剂量同前)处理,空白对照组加入培养液。从第一天到第6天,每组每天收集细胞一次,绘制各组的细胞生长曲线。(2)通过流式细胞仪来分析rAd-p53和EPI对细胞周期进程的影响。(3)SGC-7901细胞接种于预置无菌盖玻片的6孔培养板中,按前述步骤加药培养48小时,瑞氏染色15分钟并在显微镜下观察细胞形态。(4)裸鼠皮下种植SGC-7901细胞株构建胃癌的异位种植瘤模型,检测移植瘤瘤体积大小。当肿瘤生长至直径3-5mm时,将荷瘤裸鼠分成三组,rAd-p53治疗组8只裸鼠,EPI治疗组8只,对照组6只,分别注射10μl 1012 vp/ml rAd-p53,1.25 mg/kg体重EPI,以及10μl0.9%生理盐水。每次注射前测量裸鼠体重和肿瘤体积。最后一次注射后两天,所有的裸鼠被人道处死。收集血标本、肿瘤标本、主要脏器(如心脏、肺脏和肝脏)进行生化和组织学研究。(5)福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织切成5-μm厚的组织切片,常规HE染色后光学显微镜下观察肿瘤特征。(6)将各组的肿瘤标本溶解,用Western blot方法检测p53蛋白的表达。(7)每只裸鼠的血清用生理盐水按1:10的比例稀释。使用生化分析仪检测每只裸鼠血清的肝、肾和心功能指标。肝脏和心脏的组织病理学研究同样采用石蜡包埋标本以及HE染色。 结果:(1)rAd-p53、EPI和联合治疗组在第一、二天对SGC-7901细胞的抑制率分别为32.26,35.48,43.44%和70.62,78.82,87.15%。与对照组比较rAd-p53和EPI治疗组显著抑制了SGC-7901细胞的生长(p0.01)。对SGC-7901细胞治疗5天后,rAD-p53和EPI治疗组的细胞抑制率分别为93.75%和98.96%,而联合治疗组细胞生长抑制率为100%(p0.01)。(2)与对照组比较rAd-p53和/或EPI显著影响了SGC-7901细胞的周期分布,G0/G1期细胞的比例下降,而S期细胞与对照组比较显著上升(p0.05)。在rAd-p53治疗组以及联合治疗组中出现了一个明显的亚-G1峰,提示有凋亡细胞。(3)瑞氏染色后,对照组SGC-7901细胞呈梭形,互相聚集,细胞结构完整而清晰;在EPI治疗组中,聚集细胞与对照组比较似乎有所减少,而且有分散的细胞出现;经过rAd-p53治疗48小时后,细胞之间的连接消失,细胞的数目明显减少,呈分散、单个,形态较正常细胞发生改变:细胞质染色加深,细胞核破裂成小片状,显微镜下可以看见数个凋亡细胞;在联合治疗组中,细胞数目稀少,可见几个细胞碎片。(4)三个裸鼠皮下肿瘤治疗组的肿瘤生长曲线显示,从第六次注射开始到终点,rAd-p53治疗组的肿瘤体积显著小于对照组(p0.01)。rAd-p53和EPI治疗组肿瘤大小没有显著性差异。三个治疗组裸鼠的体重在治疗期间没有显著性差异(p0.05)。(5)在光学显微镜下观察肿瘤组织标本,在对照组中没有发现组织坏死,肿瘤形态和结构良好;在EPI治疗组中,裸鼠肿瘤组织坏死不明显;而在rAd-p53治疗组裸鼠肿瘤组织中,可以观察到明显的坏死,并且有一些淋巴细胞浸润。(6)用Western blotting检测不同治疗组p53蛋白的表达,rAd-p53、EPI和对照组的灰阶比率分别为0.234,1.012和1.309。(7)检测裸鼠的血清生化指标,血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)在对照组裸鼠中分别为92.5±8.86U/L,198.75±50.83U/L和1227.5±314.22U/L;在rAd-p53治疗组中有2只裸鼠发现有上述指标的显著增高。该结果通过裸鼠肝脏组织切片HE染色证实,显示2只裸鼠的肝脏发生了严重的肝炎。血清CK和CK-MB在对照组裸鼠中分别为743.75±214.339U/L和773.75±227.718U/L。在EPI治疗组中有1只裸鼠上述两种酶的显著升高,并且该结果通过组织病理学得以证实。裸鼠EPI治疗组中肾功能指标BUN显著高于其它两组(p0.05)。在治疗组裸鼠中其它的酶指标并未显示出任何异常。 结论:本研究细胞试验研究证实,rAd-p53与EPI有相似的肿瘤抑制率(P0.05),但是两者均显著高于对照组(P0.01)。组织学研究提示在rAd-p53治疗组中有显著的肿瘤坏死和凋亡发生。用Western blott检测了p53蛋白的表达,与对照组比较,p53蛋白表达水平在rAd-p53和EPI治疗组中降低。在本研究裸鼠实验中,rAd-p53治疗组8只裸鼠中的2只出现了肝脏毒性,对出现肝损伤的试验动物没有进行特殊治疗,然而在试验期间也没有发生实验动物的死亡;在EPI治疗组中,8只裸鼠中的1只出现了心脏毒性反应,与前述类似,在试验期间EPI治疗组中没有出现试验动物的意外死亡,表明本试验中rAd-p53和EPI的使用剂量是安全的。总而言之,本试验证实rAd-p53无论在体外或是体内均能显著抑制胃癌细胞SGC-7901,并且与EPI有协同杀伤效应。这提示了胃癌治疗的一种新的可能,即化疗加基因治疗。


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