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紫稻细胞质雄性不育系水稻线粒体呼吸链初步研究

严志祥  
【摘要】:雄性不育是水稻杂种优势的基础,细胞质雄性不育的利用在水稻育种中占有重要的地位。云南紫稻细胞质雄性不育系是我们创建获得的一种新型细胞质雄性不育系。本项研究围绕云南紫稻型细胞质雄性不育材料进行了两方面的工作:构建线粒体基因文库和检测线粒体呼吸链酶复合体功能。主要研究内容如下: 1.以云南紫稻细胞质无花粉型水稻樱香不育系和保持系为材料,构建了不育系和保持系的线粒体基因组的BAC文库。每个文库均保存2304个菌落,外源插入片段介于10-20kb之间。将两个文库的2304个克隆分别集中于96孔板中,根据已发表的水稻线粒体序列对atp6、atp9、cob、cox2等4个基因设计特定引物,对96孔板中的菌落进行PCR鉴定,均能筛选得到阳性克隆,通过对96孔板中阳性克隆的位置进行推导可以得到文库中含有相应基因的克隆的大致位置及数目。PCR筛选结果显示两个文库均包含用于检测的目的线粒体基因,说明文库典型性良好。在文库的基因筛选过程中,将2304个菌落排列为48 x 48的组合,使用特定的基因引物对菌落直接进行PCR反应,最少只需要96个PCR反应即可定位目的基因在2304个菌落中的位置坐标。运用数学方法简化生物学实验设计是本研究的创新点。 2.以云南紫稻细胞质无花粉型水稻天香不育系和保持系及F1代为材料(“天香”品种为樱香品种的商品用名),分离纯化得到完整的线粒体后,运用BN-PAGE (blue native polyacrylamide gel electrophoresis)技术分离出完整而且具有酶活性的位于线粒体内膜的线粒体呼吸链蛋白复合体,然后与酶活性的原位酶活检测技术联用,比较分析不同材料线粒体各复合体的酶活性差异。在材料的使用上,我们创新性地分别比较了黄化苗来源的三种材料(代表只有线粒体呼吸作用代谢的状态)和绿叶来源的三种材料(代表了同时存在线粒体呼吸作用和光呼吸作用代谢的状态)。我们的试验结果认为云南紫稻型细胞质雄性不育系中线粒体呼吸链的复合体功能缺陷在于复合体I(NADH脱氢酶)而不是预测中的复合体V (ATPase),并且NADH脱氢酶活性的缺陷与叶绿体和光呼吸作用密切相关。我们同时发现,紫稻型细胞质雄性不育系和保持系中均存在同一个orf79的同源基因(orf79的同源基因被认为是水稻雄性不育的相关基因),这一现象部分解释了不育系和保持系中ATPase活性的一致性。另外,我们也尝试对BN-PAGE电泳分离的膜蛋白复合体进行第二向电泳,试图分离出其组成的亚基,以确定导致功能缺陷的亚基从而推导出编码基因的序列差异,最终成为利用构建的线粒体基因组文库研究雄性不育机理的着手点。


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