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整体柱预富集及其与毛细管电泳联用技术的研究

冯艾荣  
【摘要】:毛细管电泳(Capillary electrophoresis, CE)具有分离效率高、分析时间短、样品和试剂消耗量小、易于自动化等优点,已成为生物分子分析的重要手段。然而,由于生物样品的复杂性,通常无法对未处理的复杂样品直接分析。同时,在临床和生物医学研究中常常面临微量生物样品的分析。如何提高CE的检测灵敏度及处理复杂样品的能力,实现对复杂样品中微量生物分子的分析就成为迫切需要解决的问题。 固相萃取(Solid phase extraction, SPE)是通过选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行纯化、富集和分离的技术,可以直接用来处理复杂样品、并可通过增大进样体积来富集低浓度样品。SPE与CE联用,可对复杂样品进行预处理,提高CE分析实际生物样品的能力。SPE-CE的联用包括离线(off-line)、连线(at-line)、在线(on-line)和在柱(in-line)等方式。前二者是萃取和电泳分开进行的联用方式,在操作过程中样品可能遗失,因此对于微量生物样品的分析存在很大风险。在线联用大多借助阀、套管等实现萃取单元与分离毛细管的连接,接口的存在可能会导致分离效率的明显降低。在柱联用则是将SPE和CE整合在同一根毛细管上,同时实现样品的预富集、除杂及电泳分离,操作简单,具有非常好的自动化潜力。但由于毛细管中固定相制备技术的限制,在柱联用的实现较为困难。整体柱技术的发展,为SPE-CE的在柱联用提供了契机。整体柱是一种原位聚合的连续床固定相,主要包括无机硅胶整体柱和有机聚合物整体柱,具有制备简单、结构均匀、通透性好、柱容量大等优点,是近年来发展迅速的SPE固相材料。 本论文以整体柱的制备及其与CE的联用作为研究课题,制备了一种氨基硅胶整体柱用于DNA的萃取,研究在同一根毛细管上实现DNA的萃取和电泳分离的方法,建立了SPE-CE在柱联用分析DNA的新技术;另外还成功制备了一种亲和聚合物毛细管整体柱,并对其免疫预富集的效果进行了研究,尝试了将其与CE在柱联用用于蛋白质的分析。本论文的工作主要包括以下部分: 1.在前言部分首先评述了整体柱的制备方法,介绍了溶胶-凝胶技术制备硅胶整体柱的原理及各个相关步骤,包括反应物的选择、烷基硅氧烷的水解浓缩反应、相分离和成胶、陈化、干燥、柱体表面修饰等;介绍了不同种类聚合物整体柱的制备方法,包括聚丙烯酰胺类、聚苯乙烯类和聚甲基丙烯酸酯类等整体柱。其次,介绍了毛细管电泳的基本原理及其在在DNA、蛋白质分离检测中的应用;最后,对整体柱在SPE预富集与CE联用技术中的应用及研究进展进行了详细的综述。 2.研究制备了一种氨基硅烷杂化整体柱并对其进行了表征。采用溶胶-凝胶技术,以四乙氧基硅烷(TEOS)和N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷(AEAPTES)作为反应单体,在乙醇、水和致孔剂的共同作用下制备了一种氨基硅烷杂化整体柱(反应原理如图1所示)。 考察了反应条件对氨基硅胶整体柱制备的影响,包括水含量、TEOS和AEAPTES的比例、硅烷单体总量、致孔剂等因素。在TEOS和AEAPTES的单体比例为固定为4:1前提条件下,当硅烷总量为25%时,硅烷交联产物量较小;此后随着硅烷总量的增加,反应产物量增大;当硅烷总量超过50%时,反应不完全。因此硅烷总量被控制在40%-50%之间。在溶胶-凝胶反应中,含水量的多少不仅影响硅烷水解聚合反应的速度,更影响水解聚合反应的完全程度以及形成硅胶交联物的收缩性能。当含水量为1%时,聚合反应不完全,大量硅烷单体残留;随着含水量的增加,硅烷残留物减少;当含水量达到15%时,聚合反应完全;若含水量继续增加,硅胶交联产物量变化不大,但整体柱干燥后收缩严重。因此选择了15%的含水量。硅烷单体TEOS和AEAPTES的比例也会影响到聚合反应的速度及产物的结构。固定含水量及硅烷总量,考察了硅烷单体比例对聚合反应的影响。实验发现,当TEOS与AEAPTES比例为2:1时,聚合反应不完全;当比例增加到4:1时,聚合完全,形成均一的整体柱材料;当比例继续升高到6:1时,整体柱产物易发生断裂;故选择硅烷单体比例为4:1。致孔剂对整体柱孔结构的形成具有决定性作用,实验中比较了两种致孔剂十二烷基溴化铵(CTMAB)和聚乙二醇10 000(PEG 10 000)对整体柱孔结构的影响。通过对硅胶毛细管整体柱的显微形貌观察发现,采用CTMAB为致孔剂时,整体柱具有较多的穿透孔且孔分布均匀;以PEG10 000为致孔剂时,穿透孔孔径较小。因此选择CTMAB作为氨基硅胶整体柱的致孔剂。 在优化的溶胶-凝胶反应条件下,在250微米内径的熔硅毛细管中成功制备了氨基硅胶杂化整体柱。通过SEM图观察其穿透孔孔径约5微米,骨架尺寸约2微米,不同放大比例的SEM图如图2所示。利用氮气吸附-解吸附实验,计算出整体柱材料的中孔孔径分布为10-40纳米,总表面积为29.395 m2/g。 因此,实验优化出的整体柱制备条件为:15%的水含量,40%的硅烷总量,TEOS与AEAPTES比例为4:1,CTMAB作为致孔剂。以此条件制备的整体柱通透性好、机械强度高、孔结构均匀、比表面积大。与常规的溶胶-凝胶法制备硅烷整体柱的过程相比,此氨基硅胶杂化整体柱制备过程简单,具体表现在:(1)不需要加入酸或碱作为催化剂。氨基硅烷自身所带的氨基基团使得整个反应体系呈弱碱性,起到催化剂的作用,因此整个反应是“自催化”的过程。(2)溶胶-凝胶反应结束后不需要对整体柱进行后修饰。氨基硅烷所带的氨基使得整体柱在酸性和中性缓冲液中带正电荷,具有弱阴离子交换功能。(3)整个反应过程无需高温灼烧或碱扩孔处理,避免了整体柱结构中离子交换基团的流失。 3.研究将制备的氨基硅胶杂化整体柱用于DNA固相萃取的的方法。DNA的固相萃取包括如下图所示的四个步骤:预平衡、样品加载、清洗及洗脱。采用实验室构建的毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)装置对DNA萃取过程中的实验条件进行了优化。 首先研究了加载液。当加载液pH为6时,DNA在整体柱上能形成有效的保留;加载液pH从6升高到9时,DNA在整体柱上的保留略有减少;加载液pH值升至9以后,DNA在整体柱上的保留量急剧降低,其在pH 11时的保留量仅为pH 7时的20%。加载液中不同竞争离子对DNA吸附性能有较大影响,比较了Tris-EDTA(TE)、NaCl、Na2HPO4-NaH2PO4三种加载液对DNA吸附性能的影响。结果表明,加载液为TE时DNA保留量最高,NaCl时次之、Na2HPO4-NaH2PO4时最低。相同浓度加载液中,如50 mM时,DNA在Na2HPO4-NaH2PO4中的保留仅为其在TE中的23%。因此选择TE为加载液。加载液离子强度对DNA保留也有影响,比较了10-500 mM TE加载液中DNA的保留量。结果表明,低浓度时DNA保留能力强,随着浓度的增高保留能力逐渐减弱。DNA在500 mM TE中的保留量为10 mM浓度时的41.6%。为了避免加载时蛋白质和其它竞争离子的干扰,选择50 mM TE缓冲液作为加载液浓度。洗脱液的性质直接影响到整体柱的萃取效率,因此着重研究了洗脱条件。在pH 10的条件下,研究了10-500 mM的磷酸钠缓冲液对DNA洗脱能力的影响。在磷酸钠浓度低于50 mM时,DNA难以洗脱下来。随着缓冲液浓度的增大,对DNA的洗脱能力急剧增强。综合考虑对提取DNA后续应用的影响,选择200 mM的磷酸钠缓冲液(pH 10)作为DNA的洗脱溶液。 在优化的条件下,以鲱鱼精DNA为对象,评价了此氨基硅胶毛细管整体柱的萃取性能,包括整体柱的容量、萃取效率和重现性等。结果表明,6厘米的整体柱的柱容量为48 ng DNA,萃取效率为74%,萃取效率的RSD为6.1%。另外,考察了该方法用于实际生物样品DNA固相萃取的可行性。研究了从Bacillus substilis(B. substilis)裂解液中直接提取PBE2质粒DNA的方法,监测了萃取过程中蛋白质含量的变化,并采用聚合酶链式反应(PCR)扩增来判断提取的DNA是否适合于下游应用操作。结果表明,在加载和清洗过程中,B. subtilis裂解液中大部分(90.6%)的蛋白质被TE洗去,PBE2质粒DNA片断可有效用于PCR扩增。 研究表明氨基硅胶整体柱主要是通过氨基官能团与DNA上磷酸基团的静电作用来实现对DNA的吸附,因此在萃取过程中可通过调节溶液pH来有效控制DNA的吸附与解吸附,使其有别于DNA常用固相萃取方法,避免了高浓度熵盐和有机溶剂的使用,萃取获得的DNA能更方便地用于PCR、克隆、转化等基因工程操作。此外,此氨基硅胶杂化整体柱具有高容量、可有效的去除生物复杂样品中杂质的干扰,对实际样品的纯化有非常重要的意义。 4.利用制备的氨基硅胶杂化整体柱,建立了SPE与CE在柱联用分析DNA的方法。在熔硅毛细管的一端原位聚合一段氨基硅胶杂化整体柱用于DNA的富集,毛细管剩余部分用作DNA的电泳筛分通道,建立了SPE与CE在柱联用的分析方法,其操作过程如图4所示,具体包括样品加载、清洗、筛分介质导入、洗脱和CE等步骤。 系统优化了在柱操作条件,包括样品加载液的选择、筛分介质的导入方式、洗脱液的组成和洗脱时间等。根据DNA在氨基硅胶杂化整体柱上的吸附特性和在CE中的分离条件,选择pH 7,50 mM TME (Tris-Mes-EDTA)为加载液。比较了压力方式和电渗流(EOF)方式导入聚合物筛分介质的效果,选用压力方式导入筛分介质。SPE与CE的在柱联用过程中,吸附的DNA样品经过洗脱后将随洗脱液进入电泳筛分通道,洗脱液可能严重干扰后续的电泳分离过程,因此,洗脱液的选择至关重要。比较了不同洗脱液,包括磷酸钠、碳酸钠、不同浓度氨水,对在柱SPE-CE分析的影响。结果表明磷酸钠洗脱液会严重影响CE的分离效率,碳酸钠洗脱液洗脱不完全,20 mM氨水时能同时获得较好的洗脱效果和分离效率。此外,在柱联用过程中,洗脱时间会直接影响洗脱液区带长度进而影响电泳的分离效率。考察了不同洗脱时间对在柱SPE-CE的影响。结果发现洗脱时间为15 s时,只有部分DNA从氨基硅胶杂化整体柱上洗脱下来进入分离过程;洗脱时间增加到25 s时,DNA的洗脱量增加,能获得较满意的分离效率;洗脱时间继续增加,DNA分离效率明显下降。 在优化的条件下,评价了在柱SPE-CE对DNA标准片段DL2000(100,250,500,750,1000,2000 bp)分析的检测限(LOD)、分离效率及重现性。结果表明在柱SPE-CE对六个片段的LOD分别是0.065,0.072,0.091,0.096,0.112和0.123ng/mL,理论踏板数为333 560-40 461, RSD为7.4-10.6%。与常规CE分析的LOD相比,在柱SPE-CE对六个片段的预富集因子为103.97-215.22。 在此基础上将其同于实际生物样品的分析,用于Escherichia coli(E. coli)裂解液中pMD-18T重组质粒DNA直接分析。常规CE分析E. coli裂解液时,CE杂峰多,峰形差。在柱SPE-CE则能消除杂峰干扰,有效分析pMD-18T重组质粒。 对于DNA分析而言,由于在电泳分析中通常要求在毛细管内填充高分子筛分介质,要实现DNA的SPE-CE的在线联用,在技术上较其它小分子的分析更加困难,目前在国内外还未见有成功的报道。在本部分工作中,通过使用的合适的整体柱材料及洗脱条件的优化,使DNA的洗脱与电泳分离的相匹配,实现了DNA的SPE-CE的在线联用。该技术可同时实现DNA样品的预富集、杂质(如无机离子、蛋白质、内毒素等)去除、CE分离,操作简单,可用于复杂生物样品中DNA的分析,将成为生命科学研究的有效工具。 5.发展了一种基于聚合物整体柱的在柱免疫富集-CE联用方法。在甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)涂层的熔硅毛细管一端原位热聚合制备了一种以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂、偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂,环己醇和十二烷醇为致孔剂的聚合物整体柱,聚合反应如图5所示。在整体柱上固定抗体作为免疫富集固定相,毛细管剩余部分用作CE分离通道。 考察了聚合反应过程中单体、交联剂及致孔剂等条件对整体柱通透性和显微形貌的影响。当致孔剂总量从60%增加到75%(v/v)时,通透性增加6倍,通孔孔径增大,可形成2微米通孔;保持致孔剂含量75%不变,单体含量从15%增加到18.75%(v/v)时,通透性增加1倍,孔分布更均匀。因此聚合反应过程中选择GMA含量为18.75%,EDMA含量为6.25%,环己醇67.5%和十二烷醇7.5%。 以二甲亚砜(DMSO)为EOF标记物,系统研究了不同类型毛细管柱EOF的差异,包括γ-MAPS涂层的毛细管、含有不同比例整体柱的毛细管柱及整体柱上固定免疫球蛋白G (IgG)的毛细管柱,探讨了整体柱EOF的形成机理。实验发现,不同类型的毛细管柱均产生阴极EOF,但大小有明显的差异。与未涂层熔硅毛细管相比,y-MAPS涂层的毛细管的EOF减少了45%;当毛细管入口端合成2厘米的GMA-EDMA整体柱时,EOF稍有减少,为涂层毛细管EOF的92.4%;当2厘米的整体柱上固定IgG时,EOF减小为涂层毛细管的65%;当聚合物整体柱长10厘米时,EOF减小为涂层毛细管的44%。 在优化的聚合物整体柱制备条件下,详细评价了整体柱的稳定性、重现性、均一性等性能。结果表明,流动相流速为1-5μL/min时,整体柱柱压与流速呈良好的线性关系(R=0.993);流速为5μL/min时背压小于37 bars;整体柱柱间通透性的RSD为5.4%;连续测定整体柱中的EOF(n=18),计算出RSD为8.77%;将整体柱毛细管在pH 7.6的缓冲液中过夜储存后测得EOF减少到储存前的91%;将整体柱毛细管在pH 2.5的缓冲液中过夜储存后测得EOF减少到储存前的26%;毛细管整体柱中切割位置不同时,得到的SEM图显微形貌差异不明显。 在GMA-EDMA整体柱上用环氧基法一步固定IgG,以荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的抗IgG抗体为模式分析物研究了制备的亲和整体柱免疫富集的有效性和整体柱上的非特异性吸附。结果表明,固定有IgG的GMA-EDMA亲和整体柱可有效的免疫富集溶液中的抗IgG抗体;整体柱对抗IgG抗体的非特异性吸附较少,在可接受范围内。采用与固定IgG相同的程序,在整体柱上固定两种抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)抗体(HT13.3和FBT10),评价了此免疫亲和系统对其他蛋白质分析测定的通用性。最后成功尝试了将固定有IgG的亲和聚合物整体柱应用于在柱免疫富集-CE联用分析抗IgG的研究中。 在优化的制备条件下,GMA-EDMA聚合物整体柱通透性好、机械强度高、在中性溶液中稳定性好、显微形貌纵向分布差异性小和重现性好。此在柱免疫富集-CE联用方法通用性强,能用于分析可提供抗体的任意分析物,非常适合生物复杂样品中微量生物标记物的分析。


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