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湖北地区汉坦病毒与宿主的基因进化研究

刘婧  
【摘要】:目的: 近十年来我国肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)的疫情发生了明显的变化,湖北地区作为HFRS的重疫区之一,流行变化的原因仍不明了,宿主及病毒自身的改变与其关系密切。基于此,本研究拟从汉坦病毒(Hantavirus, HV)及其不同宿主两方面开展研究,对湖北地区HV流行株的基因变异与进化特征和自然宿主与终宿主的基因特征、感染与分布情况进行全面分析,以了解湖北地区2000~2009年鼠间及人间汉坦病毒的感染情况和基因特征,并与1986~1987年流行的HV相比较,从而阐明近年来HFRS流行改变的原因,寻找疾病演变的规律,为制定有效的预防和控制措施提供理论依据。 方法: 1、湖北地区鼠肺标本的收集:根据全国动物Ⅲ级地理划分,获取2000~2009年间江汉平原、鄂西南山地、鄂中丘陵、鄂东丘陵4个地区的5个采样点的鼠肺标本;并收集各个地区啮齿类动物分布特征、动物种类、构成比和带毒率等资料。 2、HV阳性鼠肺标本的筛选和总RNA的提取:采集自湖北不同地区的鼠肺标本,冰冻切片后使用间接免疫荧光法检测HV抗原,提取抗原检测阳性标本的总RNA和DNA。同时采集HV阴性标本鼠肺的DNA作为对照。 3、湖北地区HFRS患者血清的收集及筛选:收集1986~1987和2001~2009年间武汉大学(原湖北医科大学)附属教学医院收治住院的部分HFRS患者血清,经临床诊断和间接ELISA法检测HV特异性IgM对标本进行筛选。 4、设计针对HV不同基因型的特异性引物,用RT-PCR法对病毒进行分型:根据GenBank中获得的汉滩病毒(Hantaan virus, HTNV)和汉城病毒(Seoul virus SEOV)的S、M片段氨基酸序列和cDNA序列,用BioEdit 7.0和Clustal W程序排列,寻找cDNA序列及对应氨基酸序列均保守的区域作为属特异性引物设计区域,进而设计一对属特异性的通用引物;随后分别设计一组型特异性HTN/SEO引物。所有HV阳性标本均通过以上引物使用RT-PCR进行基因分型和扩增。 5、宿主动物线粒体DNA (Mitochondrial DNA. mtDNA)中D环区(D-loop)基因的特异性引物设计:根据GenBank中已有的褐家鼠、黑线姬鼠、黄胸鼠等鼠的D-loop基因序列,设计引物,用于扩增来源于湖北不同地区鼠肺标本中的宿主线粒体D-loop基因。 6、HV和宿主线粒体基因序列的获得:将HTNV和SEOV的阳性PCR扩增产物以及D-loop扩增产物回收、纯化后送上海In vitro gen公司测序。若有PCR产物直接测序效果不好的样品,则采用克隆后测序。 7、HV与mtDNA D-loop序列的系统进化分析:使用生物学软件BioEdit 7.0和ClustalX 2.0进行多重序列比对。使用RDP3 Beta 4.9软件评估HTNV和SEOV核苷酸序列的基因重配情况。应用Modeltest 3.7软件中的赤池信息量准则,选择系统分析中的最佳核酸替代模型。使用PAUP* 4b 10软件和MrBayes 3.1软件中的邻接法(Neighbor-joining, NJ)和贝叶斯马尔科夫链模特卡罗方法(Bayesian Markov chain Monte Carlo, BMCMC)构建病毒与宿主系统发生树。 8、HV序列同源性分析:应用MEGA 4.1软件分析来自湖北地区不同病毒株的S、M基因序列间的遗传分歧。应用Arlequin 3.11软件和DnaSP 5.00软件分析所有的序列的等位基因及等位基因的多态性与核酸的多态性。应用Tajima's D test, Fu's Fs test and R2 test检测持续性群体的大小和种群扩张情况。为了检测分子进化选择压力,用DnaSP 5.00软件检测核酸序列无义突变(nonsynonymous, dN)和有意突变(synonymous, dS)的比值。 结果: 1、捕获动物的构成比和带毒率:共捕获687只动物,其中包括黑线姬鼠148只,褐家鼠507只,黄胸鼠32只,均为湖北地区较常见鼠类。其中褐家鼠为主要鼠种,所占比例高达73.80%。 2、鼠肺组织HV抗原的检测:687份鼠肺标本中HV抗原总检出率为6.70%,其中南漳最高为7.62%,江夏最低为6.08%。5个采样地点的啮齿动物的带毒率无统计学差异,但每个地点不同鼠种HV的检出率差别较大。南漳与蕲春地区只从褐家鼠中检测出了病抗原。 3、鼠肺组织中HV RNA和其宿主DNA的测序结果:HV RNA的测序结果显示:湖北地区鼠间流行的汉坦病毒主要为HTN型和SEO型。46份阳性鼠肺标本中,SEO型病毒有39份,HTN型汉坦病毒7份,SEOV为主要的汉坦病毒型别,占总阳性标本的84.78%。从湖北地区褐家鼠扩增出的病毒核苷酸序列均属于SEO型病毒,从黑线姬鼠体内同时检测到4份SEOV与7份HTNV,提示该地区发生了SEO型汉坦病毒的宿主转换现象,这也是首次发现在自然环境下,SEOV可以溢出感染黑线姬鼠。 4、鼠肺组织中汉坦病毒S片段序列分析:湖北地区鼠间SEOV的S片段可分为4个进化分枝。除了已知的SEO-S-#3外,还发现了3支新的进化分枝,分别命名为SEO-S-#7~SEO-S-#9。序列呈现一定的地区聚集性,来自同一采样地点的的HV基本存在于同一进化分枝内。大部分SEOV与Z37的同源性较高。湖北地区鼠间HTNV的S片段分为2个分枝,其中HTNV-S-#7为已知分枝,分枝内病毒株与76-118同源性好。HTNV-S-#10为新发现的进化分枝,与Q32的同源性较高。 5、鼠肺组织中汉坦病毒M片段序列分析:SEOV的M片段可分为5个进化分枝。与SEOV的S片段的进化树相比,SEO-M-#3和SEO-M-#8的组成分枝的成员与S片段一致;SEO-M-#7、SEO-M-#9和SEO-M-#10与S片段的进化树组成有一定的差异,提示SEO型病毒发生了基因片段的重排。所有HTNV的M片段分为两枝,HTNV-M-#-7和HTNV-M-#10,分枝组成与HTNV的S片段致。 6、宿主动物线粒体D-loop序列分析:构建采集自不同地区阳性鼠肺标本以及部分HV检测阴性标本的D-loop)序列系统进化树,结果显示HV抗原检测阴性的鼠与HV检出阳性鼠的遗传距离很小,病毒感染与宿主线粒体基因没有直接联系;分析4个SEO型毒株来源的黑线姬鼠D-loop序列发现,宿主转换与宿主线粒体基因特征无关。 7、湖北地区人间流行的HV基因分析:湖北地区2000~2009人间流行的HV为SEOV和HTNV两型,且与80年代HFRS流行高峰时期(1986~1987)的HV基因型类似。两个时间段收集的SEO型病毒株均与Z37株同源性高,HTN型病毒株与76-118株同源性高。 结论: 1、证实目前湖北地区鼠间和人间流行的HV为SEOV和HTNV两型。鼠间优势HV基因型为SEO型,HV的优势自然宿主为褐家鼠。2000~2009年间人间流行HV的基因型与1986~1987年间无较大差异,且与鼠间流行的已知SEO型病毒株Z37株和HTN型病毒株76-118株同源性高。推测鼠间病毒类型和自然宿主的变化可能是湖北地区HFRS流行趋势改变的原因之一 2、首次发现SEOV溢出感染HTNV的自然宿主黑线姬鼠,以及SEOV不同进化分枝间基因片段的重排现象,说明SEOV进化活跃。 3、发现了3个新的SEOV进化分枝和1个新的HTNV进化分枝。多个SEOV进化分枝在湖北地区同时存在,表明该地区是SEOV的重要疫源地。结合生态学和古生物学的研究,我们推测长江中下游地区可能是SEOV古老的传播中心。


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