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瞬时受体电位M8对雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞生物学行为和血管生成影响的研究

朱广斌  
【摘要】:前列腺癌是一种严重影响人类健康的疾病,在美国,每年约有四分之一的新发癌症为前列腺癌,而且,与癌症相关的死亡率在上述人群中大约占了9%的比重[1]。在疾病早期,前列腺癌细胞依赖雄激素生长和存活,所以,抗雄激素治疗在这个时期是有效的。但是,对于雄激素非依赖性前列腺癌仍然缺乏相对有效的治疗方法。 钙离子在癌症形成的信号传导中的作用已经被广泛接受[2],而且钙离子通道也可能参加了前列腺癌细胞的钙的内环境稳态的维持中[2]。近年来,瞬时受体电位(TRP)家族阳离子通道在细胞Ca2+稳态和细胞生理病理过程中起到的重要作用逐渐引起了人们的注意。Trpm8也称trp-p8,是TRP家族的成员之一,该基因能够编码一种存在广泛的阳离子通道—TRPM8,参与调节细胞内钙离子浓度[3,4],[5]。Trpm8在正常组织中的表达几乎仅限于感觉神经和前列腺[6],因而被认为是前列腺特异性基因[7]。前期研究表明Trpm8在前列腺癌组织中表达是增加的,而且其表达水平与前列腺癌分级密切相关,所以Trpm8基因的表达可作为一种潜在的诊断指标和肿瘤标记物[8-10]。TRPM8的表达变化也许与细胞Ca2+转运和肿瘤生物学有关,但其在正常前列腺组织和前列腺癌中的确切生理功能还不清楚。而小干扰RNA (siRNA)干扰实验则表明TRPM8介导的Ca2+内流在前列腺上皮细胞Ca2+稳态中至关重要,沉默该上皮细胞内TRPM8表达能诱导细胞凋亡[11],而通过受体阻断剂阻断TRPM8通道,同样可以诱导前列腺癌LNCaP细胞的凋亡,说明TRPM8通道为前列腺上皮细胞存活所必需。 本课题拟分别在体外和体内水平探讨TRPM8通道对人雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞生物学行为和血管生成的影响。 第一部分瞬时受体电位M8对雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞生物学行为和血管生成影响的体外研究 目的:转染雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞,筛选稳定表达TRPM8的PC3细胞系。检测TRPM8通道的功能,并探讨TRPM8通道对PC3细胞生物学行为和血管生成的体外影响。 方法:实验分为三组:实验组(稳定表达TRPM8增加的PC3细胞株)、空载体对照组(稳定转染空载体的PC3细胞株)、空白对照组(未作任何处理的的PC3细胞株)。常规培养雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞,分别将空载体pcDNA3和pcDNA3/TRPM8质粒转染至前列腺癌PC3细胞,筛选出稳定表达细胞系:空载体对照组和实验组。分别通过Western blot和RT-PCR检测TRPM8在实验组细胞和空载体对照组的表达水平;分别通过Western blot,流式细胞术和细胞划痕实验检测TRPM8对PC3细胞的周期分布、细胞迁移、抗凋亡能力以及血管生成的影响。 结果:成功转染并筛选出稳定表达TRPM8增加的PC3细胞株和稳定转染空载体的PC3细胞株。细胞周期检测结果表明空白对照组细胞,空载体对照组细胞,以及实验组细胞位于G0/G1期的百分率分别为53.48%,52.83%,以及69.00%(p0.05),实验组和其他两组比较有统计学差异;空白对照组细胞,空载体对照组细胞,以及实验组细胞凋亡率分别为4.47%,4.88%,以及11.40%(p0.05),实验组和其他两组比较有统计学差异。划痕实验结果表明:划痕24小时后,空白对照组细胞,空载体对照组细胞,以及实验组细胞的迁移率分别为100%,97%,和65.47%(p0.05),实验组和其他两组比较有统计学差异。Western blot结果提示与空载体对照组细胞和空白对照组细胞相比,实验组细胞的VEGF, Bcl-2蛋白表达水平降低。 结论:增加TRPM8的表达能抑制前列腺癌PC3细胞的增殖、迁移和血管生成,并诱导细胞凋亡。 第二部分瞬时受体电位M8对雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞生物学行为和血管生成影响的体内研究 目的:在体内水平探讨TRPM8通道对雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞生物学行为和血管生成的影响,初步探讨TRPM8在前列腺癌形成过程中的作用,以期为前列腺癌基因治疗寻找一条新的途径。 方法:实验分为三组:实验组(稳定表达TRPM8增加的PC3细胞株)、空载体对照组(稳定转染空载体的PC3细胞株)、空白对照组(未作任何处理的PC3细胞株)。将三组细胞分别注射于裸鼠右侧腋下皮下,建立荷瘤鼠模型。肿瘤形成后每3天测量瘤体大小,并计算肿瘤体积,绘制生长曲线;四周后处死各组荷瘤鼠,称出各瘤体重量,取肿瘤标本行Western blot检测VEGF和Bcl-2蛋白的表达水平;用CD31抗体和PCNA抗体行免疫组化。以CD31抗体标记微血管,行微血管密度检测。 结果:成功构建了裸鼠荷瘤模型,肿瘤形成后,实验组裸鼠肿瘤生长速度明显低于空载体对照组和空白对照组,有统计学差异(p0.05);各组瘤体重量:实验组的瘤重为(1.97±0.12)g,与空白对照组(2.78±0.05)g和空载体对照组(2.62±0.10)g比较明显降低(p0.05),实验组和其它两组间有统计学差异,空载体对照组和空白对照组之间没有统计学差异,瘤重抑制率为28.62%。Western blot结果提示:与空载体对照组和空白对照组相比,实验组肿瘤的VEGF, Bcl-2蛋白表达水平降低。免疫组化结果提示:实验组裸鼠的皮下移植瘤的增殖指数(SPF值)为(67.92±0.02)%,与空白对照组(80.93±0.01)%和空载体对照组(78.93±0.02)%相比显著降低(p0.05);实验组裸鼠的皮下移植瘤的MVD值为29.66±6.04,与空白对照组(38.82±12.11)和空载体对照组(37.50±9.97)相比显著降低(p0.05);MVD和VEGF的蛋白水平呈正相关关系(r=0.419,p=0.021)。 结论:增加TRPM8基因的表达能在体内水平抑制前列腺癌PC3细胞的增殖和血管生成。揭示了TRPM8基因在前列腺癌的形成过程中起着重要作用,实验结果也为前列腺的基因治疗提供了一条可能的途径。


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