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黑色素瘤抑制因子2(MIA_2)与乙型肝炎病毒(HBV)感染相关性研究

徐伊琳  
【摘要】:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)特异性的感染灵长类动物的肝组织,是引起人类全球性的慢性肝炎,肝坏死和肝细胞癌的重要因素之一.已有研究表明乙型肝炎病毒基因组具有五个启动子区域,调控着病毒的转录进而影响病毒的复制,而病毒启动子区域存在一系列肝特异性核受体因子如HNF1α, HNF4α和PPARα-RXRα的结合位点,使得乙肝病毒的感染具有肝特异性。 近期报道了一个新发现的肝特异性表达蛋白,属于MIA家族,被命名为MIA2。该蛋白的表达主要在启动子水平受到核受体因子HNF1的调控。在本研究中我们主要想阐明在HBV病毒的感染致病过程中MIA2的表达有何变化,而该蛋白本身对于HBV病毒的转录和复制有何影响,从而为阐明HBV病毒感染导致的肝细胞疾病的发生发展的分子机制打下基础,同时为乙型肝炎和肝细胞癌的防治提供了理论基础。 为了研究MIA2与HBV感染之间的相互关系,我们首先检测了慢性乙肝病毒感染病人和健康人血清中MIA2的表达水平。经过ELISA检测,我们发现慢性乙型肝炎病人血清中MIA2的含量(186.5±35.46pg/ml)较之健康人血清中的含量(265.9±34.44pg/ml)明显要低。而用RT-PCR和ELISA方法比较HepG2和HepG2.2.15细胞中MIA2的mRNA和蛋白含量表明HepG2.2.15(61.94±3.77pg/ml)细胞中MIA2含量明显低于HepG2(150.51±4.28pg/ml)细胞。 为了研究HBV感染与MIA2之间的关系,我们将MIA2的cDNA构建到真核表达载体pCMV-Tag2B(?)中,采用本实验室构建的HBV感染性克隆PHBV4.2感染HepG2细胞产生HBV病毒颗粒,通过ELISA法检测被感染的HepG2细胞上清中HBsAg和HBeAg表达水平,并采用荧光定量PCR的方法检测被感染的HepG2细胞中HBV复制中间体共价闭合环状DNA水平,结果发现MIA2蛋白在细胞水平能够促进HBV的蛋白表达和复制。此外,我们合成了针对MIA2的siRNA,发现当MIA2的表达被干扰之后,HBV的复制水平也被抑制,这从反向遗传学方面也证明了MIA2对HBV的复制能起到促进作用。 接着我们想探讨MIA2调控HBV复制的分子机制。我们将MIA2与HBVCore/Enhancer Ⅱ启动子共转染到HepG2细胞,结果显示MIA2可以上调HBVCore/Enhancer Ⅱ启动子的活性。已有报道在HBV Core/Enhancer Ⅱ启动子上有一系列转录因子作用位点,包括HNF-1,Spl,C/EBP,HNF-4和PPARa-RXRα。通过干扰RNA筛选实验,我们发现当干扰HepG2细胞中的PPARα后,MIA2对HBV Core/Enhancer Ⅱ启动子的上调作用被很大程度上削弱,说明PPARα在MIA2对HBV Core/Enhancer Ⅱ启动子的激活过程中起到关键的作用。接着通过染色质免疫共沉淀ChIP实验证实MIA2可以增强PPARα与HBV Core/EnhancerII启动子上对应位点的结合。最后通过Western Blot和EMSA实验证实,过表达MIA2可以上调全细胞以及细胞核中PPARα的表达。这都说明,在MIA2对HBVCore/Enhancer Ⅱ启动子的调控中,PPARα起到非常重要的作用。


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