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重编程诱导因子Lin28A/B在口腔鳞状细胞癌恶性转化中的作用及机制

吴添福  
【摘要】:口腔癌是头颈肿瘤的主要类型,全球每年至少有275000个新确诊的病例(Jemal et al.,2011),死亡率较高,生存下来的患者也常常因肿瘤切除引起颜面,咀嚼,语音等方面的形态和功能上的缺陷。在过去的三十年,临床上的手术方式、功能修复、术后感染控制、辅助放化疗等技术有明显的提高和改善,对口腔癌的早期诊断治疗、发生发展机理、生物治疗、靶向治疗等研究也获得了一些进步(Wamakulasuriya,2009)。但是,患者的五年生存率仍然没有得到明显的提高,不超过50%(Warnakulasuriya,2009)。其主要原因是对口腔癌的发生发展、关键调控因素、特异性标记物等不清楚。因此,探讨口腔癌的发生、发展的机理,思考潜在的治疗靶标,研究相应的治疗策略和临床应用可能,对提高患者的生存率和改善预后具有重要的意义。 LIN-28是秀丽隐杆线虫发育过程中的异时性调控基因,在人类中存在Lin28A和Lin28B两种同源物。近年研究表明Lin28是重编程诱导因子之一,可与Oct4, Sox2, Nanog一起重编程基质细胞为iPS细胞。Lin28具有RNA结合蛋白的作用,通过抑制miRNA尤其是let-7miRNAs的生成(Huang,2012),以及抑制细胞生长、代谢相关mRNA的转录起到多能干性因子的作用,参与机体的发育、干细胞更新、肿瘤发生以及代谢等过程。Lin28在口腔癌中的表达、定位和作用尚不清楚。本研究旨在通过检测Lin28的两种类型Lin28A、Lin28B在口腔癌中的表达、定位、与肿瘤性质以及患者生存预后的关系,进而分析Lin28对口腔癌的潜在作用。研究将有助于认识重编程诱导因子Lin28在口腔癌中的作用,推动重编程与口腔癌肿瘤细胞干性相关特征的研究。 第一部分重编程诱导因子Lin28A、Lin28B在口腔癌中的表达及其与肿瘤性质、临床特征、患者预后之间关联的研究 目的:iPS细胞涉及的癌基因、干细胞特征、致瘤性对肿瘤学研究有一定的参考意义。iPS过程涉及的重编程诱导因子在口腔癌中的作用尚不完全清楚。本节内容目的是验证重编程诱导因子Oct4、Sox2、Klf4、Nanog和c-Myc在口腔癌中的表达水平,检测Lin28A、Lin28B在口腔鳞癌中的表达及定位,分析Lin28A/B之间及其表达水平与口腔癌临床病理因素之间的关系。方法:SP免疫组织化学法被用来检测Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28A、Lin28B在口腔癌标本,以及非癌对照组织中的表达;采用免疫荧光双染法检测Lin28A、Lin28B的亚细胞定位采用SPSS进行相应的数据统计,分析Lin28A、Lin28B的表达与口腔癌的临床资料、肿瘤病理特征以及患者生存预后之间的统计学关联;结果:Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28A、Lin28B均表达于口腔癌中;Lin28A高表达于全部检测的口腔癌标本中、Lin28B高表达于69/72(95.8%)的口腔癌标本中;与正常对照组织相比,Lin28A与Lin28B一样在口腔癌中高表达(p0.001); Lin28A表达于61%口腔癌的细胞浆中,Lin28B表达于70%口腔癌的细胞中;单因素分析显示Lin28B与患者的性别有关(p=0.005),与患者的肿瘤细胞分化程度有关(p=0.024);生存分析显示高表达Lin28A、Lin28B的患者具有较早的疾病复发趋势(p=0.16,p=0.06);多因素COX比例风险模型分析提不Lin28B与患者的不良预后有关(HR=2.5,p=0.001),可作为口腔癌的独立预后指标。结论:重编程诱导因子与口腔癌存在一定的关联;Lin28A、Lin28B高表达于癌细胞中且亚细胞定位不同,可能通过不同的机制参与口腔癌的发生发展;Lin28B而非Lin28A可作为口腔癌的独立预后指标,其及相关通路蛋白可能具有潜在的治疗靶标价值。 第二部分Lin28B在口腔癌细胞系中的表达、Lin28B稳定过表达细胞株系的建立及对肿瘤细胞生物学特征的影响 目的:Lin28B与患者的不良预后有关,但是Lin28B在口腔癌细胞系SCC9、SCC15、 SCC25中的表达水平和对口腔癌细胞的作用尚不清楚。本节内容的目的是检测Lin28B在口腔癌细胞中的表达水平,观察干预表达水平对肿瘤细胞迁移、侵袭以及克隆形成等生物行为的影响。方法:采用qRT-PCR、Western blot检测Lin28B在口腔癌细胞系SCC9、SCC15、SCC25中的转录和翻译水平。构建稳定表达Lin28B的细胞株系,检测Lin28B对口腔癌细胞迁移、侵袭、克隆集落形成等细胞行为的影响,检测IL-6、STAT3、HMAG2、Snai、Twist、E-cadherin、Survivin、 VEGF等炎症、上皮间充质转化、凋亡以及血管生成等相关指标的改变。结果:Lin28B低表达于口腔癌细胞系SCC9、SCC15以及SCC25中;Lin28B促进肿瘤细胞迁移、侵袭、克隆形成(p均0.05);Lin28B可显著上调口腔癌细胞中IL-6、 STAT3、HMGA2、Snail、Twist和VEGF的表达(p均0.05),E-cadherin的表达水平略有下降。结论:与不同于口腔癌组织不同,Lin28B低表达于癌细胞系中;Lin28B能够通过IL-6/STAT3加重组织的炎症反应,通过EMT作用、细胞凋亡抵抗以及促进血管生成等作用促进肿瘤的远处转移和细胞的恶性转化。 第三部分Lin28B稳定转染细胞株系对口腔癌细胞体内成瘤的影响 目的:体外实验表明Lin28B可促进口腔癌细胞的炎症和EMT相关标记物的表达,但是Lin28B对肿瘤发展的作用尚不清楚。本节内容的目的是分析稳定转染Lin28B对口腔癌细胞株系成瘤能力的影响。方法:从SCC9、SCC15、SCC25细胞中筛选稳定转染Lin28B的株系;以过表达Lin28B水平居中的细胞系进行裸鼠移植瘤实验;拍照记录肿瘤生长情况,计算瘤体大小,分析过表达Lin28B对移植瘤生长的影响;检测移植瘤中重编程诱导因子Oct4、Sox2、Lin28A、Lin28B、和Klf4的表达情况。结果:成功筛选出稳定过表达Lin28B及其空载体对照的口腔鳞癌细胞株系,其中SCC25-Lin28B的表达水平较适中:过表达Lin28B可促进肿瘤的生长;移植瘤中可检测到重编程诱导因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc以及Lin28B、Nanog的表达;过表达Lin28B组具有更强的基底侵袭性。结论:Lin28B可显著促进肿瘤的生长,提示Lin28B可能通过上述的局部炎症、EMT、抑制凋亡等作用促进口腔癌的发生发展。


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