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ICU大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒介导喹诺酮耐药基因检测和耐药机制研究

蔡璇  
【摘要】:目的:1)调查2012年1月一2013年12月武汉大学人民医院重症监护室(ICU)分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒介导的喹诺酮耐药基因qnr.aac(6')-Ib-cr和qepA基因的流行现状及分布特征;2)了解qnr.aac(6')-Ib-cr及qepA阳性菌株对喹诺酮类抗生素的耐药情况;3)探讨qnr.aac(6')-Ib-cr及qepA基因的主要传播方式和耐药机制,研究ICU中大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒介导的喹诺酮耐药基因对细菌耐药性的影响。 方法:1)收集武汉大学人民医院2012年1月-2013年12月临床微生物室从重症监护室患者所送的标本中分离培养得到的耐喹诺酮类大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌(排除同一病人同一部位重复分离的菌株);2)采用Phoenix100全自动微生物鉴定仪及药敏系统对复苏后的细菌进行鉴定,统计其以前的药敏结果;3)采用PCR(polymerase chain reaction)方法检测qnr.aac(6')-Ib-cr及qepA基因及测序;4)利用琼脂二倍稀释法分别检测qnr.aac(6')-Ib-cr及qepA阳性菌株对环丙沙星及左氧氟沙星的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentrations,MIC);并采用t检验分别比较qnr.aac(6')-Ib-cr及qepA阳性基因对环丙沙星及左氧氟沙星MIC值的差别;5)采用PCR方法检测qnr基因阳性菌株的Ⅰ类整合酶基因对;6)采用PCR方法对qnr、aac(6')-Ib-cr及qepA阳性菌株进行质粒结合试验、接合子基因扩增;7)对qepA阳性菌株及其接合株进行碳酰氰间氯苯腙(carbonyl cyanide m-chloro-phenylhydrazone,CCCP)逆转实验;8)通过ERIC-PCR技术对qepA日性菌株进行DNA的同源性分析。 结果:1)从ICU患者的标本中共收集到耐喹诺酮类抗生素大肠埃希菌(ECO)108株、肺炎克雷伯菌(KPN)131株。共检测出含qnr基因的阳性菌株108株,占总菌株数的45.2%;共检出aac(6')-Ib-cr阳性菌63株,占总菌株数的26.4%;共检出17株qepA阳性菌株,占总株数的7.1%,17株qepA阳性菌株中检测到1株肺炎克雷伯菌中存在rmtB基因,其它均为阴性。2)测序结果在NCBIGenBank上进行同源性比对,与库中相应基因的同源性为100%。3)108株大肠埃希菌对亚胺培南、美罗培南100%敏感,对头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的耐药率在10%左右,对多种抗生素耐药率较高,对环丙沙星和左旋氧氟沙星的耐药率分别为70%和65.5%;131株肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南耐药率为1.5%,这是因为有2株产KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemase)酶的肺炎克雷伯菌,对环丙沙星和左旋氧氟沙星的耐药率分别为37.2%和27.1%。4)qnr、aac(6')-Ib-cr及qepA阳性菌株对环丙沙星的MIC值均较左氧氟沙星的高,存在显著性差异;5)108株qnr阳性株中有96株I类整合酶基因检测为阳性。6)随机抽取12株qnrA、qnrB及qnrS阳性菌株进行质粒接合试验均成功,;10株aac(6')-Ib-cr阳性菌株有8株质粒接合试验成功;5株qepA阳性菌株质粒接合试验均成功,且环丙沙星结合株的MIC值比其受体株的高3-5个稀释度,左氧氟沙星结合株的MIC值比其受体株的高0-2个稀释度。7)对qepA供体株和接合株,环丙沙星在加入CCCP:匕未加入CCCP前的MIC值明显降低。8)ERIC-PCR结果显示5株qepA阳性菌株有3株大肠埃希菌的指纹图谱一致,是流行病学同源株。 结论:1)武汉大学人民医院ICU中大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌存在着质粒介导的喹诺酮类qnrA.qnrB.qnrS.aac(6')-Ib-cr-和qepA基因的流行。2)存在这些耐药基因的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对其他抗生素的耐药性也较严重,且呈逐年上升的趋势。3)qnr基因多位于整合子上,因携有整合子基因的细菌能同时携带多种耐药基因而引起细菌的多重耐药,因此我们要予以高度关注。4)质粒接合试验成功表明qnrA.qnrB.qnrS.aac(6')-Ib-cr-和qepA基因可通过质粒进行水平传播。因此我们应加大对该类耐药菌的监测,避免其大范围的院内流行。5)qepA基因可能主要介导细菌对亲水性喹诺酮类药物的耐药,qepA接合株中可能存在质粒介导的主动外排耐药机制。6)我院ICU中存在同一株大肠埃希菌的克隆。这就要求ICU要更严格加强消毒隔离措施,随时监测细菌耐药动态,预防该克隆在院内暴发流行。


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