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通过培养基优化和相关基因敲除提高枯草芽胞杆菌的产量

陈振民  
【摘要】:枯草芽胞杆菌芽胞制剂是一种广泛用于植物、动物及人类的益生菌和生物防治剂产品。然而当前过高的生产成本,限制了枯草芽胞杆菌在农业上的广泛应用。如何提高现有工业芽胞菌株的产量,特别是芽胞产量,进一步提高产品质量,降低该制剂的生产成本,成为开发价廉、高芽胞含量枯草芽胞杆菌制剂的关键之一。 本研究的目之一是运用统计实验设计方法,优化工业生产用枯草芽胞杆菌WHK-Z12的培养基来提高芽胞产量,降低该制剂的成本。我们的预备试验表明,淀粉、玉米粉、麸皮是最佳的碳源,玉米浆、豆粕及酵母抽提物是最佳的氮源。随后的Plackett-Burman筛选试验表明,玉米浆、豆粕及酵母抽提物是影响芽胞产量的关键成分,它们被用于后续的响应面优化试验。最后我们得到这三种关键培养基成分的最佳浓度分别为:玉米浆16.18g/l、豆粕17.53g/l、酵母抽提物8.14g/l,此时预测的芽胞产量最高。验证试验表明在摇瓶条和在小规模发酵罐(301)条件下,上述优化培养基的实际芽胞产量分别达到1.52±0.06×1010spores/ml、1.56±0.07×1010spores/ml。上述芽胞产量比我们能查到的相关报道中其它枯草芽胞杆菌菌株的最高产芽胞水平高了100%左右。 本研究的第二个目的是,采用多基因失活方法,研究不同自溶酶相关基因的缺失对枯草芽胞杆菌168细胞自溶的影响,期望得到一种方法来抑制枯草芽胞杆菌在高温培养下发生的细胞自溶。为研究工作的方便,我们以易于进行分子生物学操作的枯草芽胞杆菌168菌株为材料,选取了以下几个与枯草芽胞杆菌细胞自溶有关的基因:xpf(又称pcf)负责编码原噬菌体PBSX中RNA聚合酶δ类似因子Pcf,它对PBSX自溶酶Xh1A、Xh1B、X1yA及XepA的转录是必需的。skfA负责编码原噬菌体prophage1中一种对姊妹细胞具有杀伤作用的芽胞形成杀伤因子SkfA。lytC负责编码枯草芽胞杆菌营养期主要自溶酶LytC。 sdpC负责编码枯草芽胞杆菌中一种芽胞形成延迟蛋白SdpC,它能够增强SkfA的活性。cwlA负责编码原噬菌体skin中自溶酶Cw1A,而yqxH和vqxG分别编码skin中类似穿孔素蛋白YqxH和噬菌体相关的外自溶酶YqxG(本研究中含有cwlA、yqxH、yqxG的DNA片段简称为yGlA)。利用五个敲除载体(pNNB194-△xpf、pNNB194-△skfA、pNNB194-△lytC、pNNB194-△sdpC、 pNNB194-△yGlA)构建了一系列突变体,并通过测定37℃培养下突变体的菌体生长速度、生物量和活菌数,考察了它们对细胞自溶的抑制作用。结果我们发现△skfA、△lytC、△sdpC或Δxpf都能有效地控制细胞自溶,其中△stfA抑制细胞自溶的效果最好,而△yGlA对细胞的自溶活性没有影响。我们得到了在较高温液体培养条件下抑制枯草芽胞杆菌细胞自溶的最佳策略:突变体△skfA△sdpC的生长速度最快、生物量和活菌数均最高,抑制细胞自溶的效果最好。我们还发现△skfA、△lytC、△sdpC对芽胞的生产有害,△yGIA对芽胞的生产没有影响,而Δ.xpf有助于芽胞的生产。以上发现将会为我们将来通过菌株改造控制枯草芽胞杆菌在工业生产时所发生的自溶,特别是在高温培养条件下的细胞自溶,奠定理论和技术基础。


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