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DLC1基因的表达与甲状腺乳头状癌中淋巴管生成关系的临床研究

刘宇飞  
【摘要】:甲状腺癌是最常见的头颈部和内分泌恶性肿瘤,其中甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是最常见的病理类型。随着诊断技术水平的提高,近年来甲状腺癌检出的发病率明显增加并呈上升趋势,作为发展中国家,我国甲状腺癌防治形势依然严峻。 伴随分子生物学和免疫学在肿瘤学中的研究水平不断提高,人类对甲状腺癌发病机制从形态学的认识转变到基因的认识。引起基因异常表达的机制极其复杂,受遗传、表观遗传、环境以及遗传易感性等因素共同调控。长期以来,人们认为遗传学的改变在肿瘤的发生中起重要的作用。然而,随着研究的深入,研究者发现例如异常的启动子区甲基化等表现遗传学的改变也是肿瘤形成中很常见、很重要的机制,可能起到替代基因突变的作用。因此,表观遗传学和遗传学的改变可共同作用于肿瘤的发生、发展过程中。 近年来,相关基因与甲状腺癌的发生、发展以及转归的关系已经成为了研究的热点。作为一个重要的抑癌基因,肝癌缺失基因1(Deleted in liver cancer-1, DLC1)的表达下调或失活在多种肿瘤的发生、发展及转移中起着重要的作用。而其失活途径主要有杂合性缺失和甲基化。目前国内外文献中检测PTC组织DLC1基因的表达及启动子甲基化,并探讨其与PTC淋巴结转移关系的研究鲜有报道。因此,对于该基因的深入研究和全面认识,将有助于进一步了解PTC发生、发展和转移的机制,从而将为PTC的诊疗提供新的思路。本课题旨在开展这方面的研究。本研究中对PTC中DLC1基因的生物学特征进行较全面的研究,包括研究PTC中DLC1基因mRNA的表达以及蛋白的表达并结合临床病理参数探讨DLC1基因在PTC中异常表达的意义,同时探讨DLC1基因异常表达的表观遗传学调控机制。此外,本文在上述研究结果的基础上进一步研究DLC1与淋巴管生成之间的关系,并初步探讨了DLC1调控淋巴管生成的机制,为明确PTC中DLC1具有抑癌功能和转移抑制功能以及将DLC1应用于抗PTC治疗的靶点奠定了理论基础。 本研究主要包括以下两个部分: 第一部分:甲状腺乳头状癌及癌旁甲状腺组织中DLC1基因的表达及其启动子甲基化 目的:研究甲状腺乳头状癌(PTC)及癌旁甲状腺组织(pericarcinomatous thyreoid tissue, PCTT)中DLC1基因的表达状况,其启动子甲基化状态及其临床意义。 方法:采用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测PTC及PCTT组织中DLC1mRNA的表达;运用免疫印迹(Western-blotting)、免疫组化技术(immunohistochemistry, IHC)、基于量子点的免疫荧光标记技术(Quantum dot-based immunofuorescence histochemistry, QDs-IHC)检测PTC与PCTT中DLC1蛋白表达状况并观察DLC1蛋白的亚细胞定位;甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation-specific PCR, MSP)法检测两组DLC1基因启动子甲基化情况;结合临床病理参数进行统计学分析。 结果:(1)PCTT组织中DLC1mRNA平均相对表达量为0.47±0.25;而在PTC中其平均相对表达水平为0.20+0.23,显著低于PCTT组织,差异有统计学意义(F=25.403,P0.05)。40例PTC中检测到19例出现DLC1mRNA阳性表达,阳性率为47.5%,相应PCTT有32例检测到DLC1mRNA阳性表达,阳性率为80%,PTC中DLC1mRNA阳性表达率低于PCTT,差异有统计学意义(x2=9.141,P0.05)。(2)DLC1基因mRNA的表达与PTC肿瘤大小、淋巴结转移以及TNM分期有关(x2=10.948,12.031,3.879,p0.05);而与性别、年龄无关(p0.05)。(3)DLC1蛋白在PTC中的表达(0.18±0.12)低于PCTT组织(0.33±0.14),差异有统计学意义(F=27.014,p0.05)。(4)DLC1蛋白定位于甲状腺滤泡细胞的细胞质,IHC检测发现40例PCTT中7例(+十+),21例(++),8例(+),4例(-),阳性率为90.0%(36/40);40例PTC中7例(++),12例(+),21例(-),阳性率为47.5%(19/40)。与PCTT相比,PTC中DLC1蛋白表达阳性率较低,差异有统计学意义(x2=26.36,p0.05)。PTC中DLC1蛋白表达与患者的性别、年龄无明显相关(p0.05),而与肿瘤大小、淋巴结转移以及TNM分期有关(x2=18.05,15.132,7.02,p0.05);Spearman等级相关分析也显示PTC中DLCl的表达水平与患者的性别、年龄的相关性无统计学意义(p0.05),与肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期的相关性有统计学意义(rs=-0.552,-0.607,-0.381,p0.05)。(5)QDs-IHC法检测40例PCTT中9例(+++),19例(++),8例(+),4例(-),阳性率为90.0%(36/40),阳性检出率与IHC法相同;40例PTC中7例(++),14例(+),19例(-),阳性率为52.5%(21/40),阳性率略高于IHC法。与PCTT相比,PTC中DLC1蛋白表达阳性率显著降低,差异有统计学意义(x2=25.96,p0.05)。分析QDs-IHC法检测的DLCl表达与PTC临床病理参数的关系发现PTC中DLCl蛋白表达与患者的性别、年龄无明显相关(p0.05),而与肿瘤大小、淋巴结转移有关(χ2=23.594,20.338,p0.05); Spearman等级相关分析也显示PTC中DLC1的表达水平与患者的性别、年龄的相关性无统计学意义(p0.05),与肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期的相关性有统计学意义(rs=-0.651,-0.713,-0.342,p0.05)。(6)一致性分析显示IHC和QDs-IHC法两种方法标记PCTT.PTC组织和总的甲状腺组织中DLC1蛋白的效果均具有一致性(K=0.924,0.919,0.546,p0.05)。(7) DLC1基因mRNA表达与蛋白表达的正相关性。PTC和PCTT中,DLC1mRNA的表达均与DLC1蛋白的表达呈正相关(r,=0.953,0.695,p0.05)。(8)PTC中DLC1基因启动子甲基化率分别为40%,高于PCTT的12.5%,差异有统计学意义(p0.05)。PTC组织中DLC1启动子甲基化与DLC1mRNA表达负相关(χ2=13.099,rs=-0.572,P0.05),相应的PCTT里DLC1启动子甲基化与其mRNA表达也负相关(χ2=12.857,rs=-0.567,P0.05)。PTC中DLC1启动子甲基化与其蛋白表达负相关(χ2=5.657,rs=-0.376,P0.05),相应的PCTT里DLC1启动子与其蛋白表达也负相关(χ2=13.333,rs=-0.577,P0.05)。PTC中DLC1甲基化与患者的性别、年龄、淋巴结转移状况以及TNM分期无关(P0.05),而与肿瘤瘤体大小有关(χ2=12.857,P0.05) 结论:(1)DLC1基因的表达下调和缺失与PTC的发生、发展以及淋巴结转移密切相关。(2)DLC1基因启动子甲基化是PTC中DLC1基因表达下调和缺失的重要原因。 第二部分:甲状腺乳头状癌组织及癌旁甲状腺组织中血管内皮生长因子C的表达、微淋巴管密度及其与DLC1表达的相关性 目的:研究PTC及PCTT组织中血管内皮生长因子C (vascular endothelial growth factor C, VEGF-C)蛋白表达和微淋巴管密度(microlymphatic vessel density, MLVD)状况,并结合临床病理参数分析PTC中VEGF-C表达和MLVD的临床病理意义;并着重分析PTC中DLC1与VEGF-C两种蛋白表达的相关性及其与MLVD的关系。探讨它们与PTC淋巴结转移的关系。 方法:免疫组化法检测PTC及PCTT组织中VEGF-C蛋白的表达以及D2-40标记的MLVD并结合临床病理参数进行统计学分析。 结果:(1)本研究观察到VEGF-C阳性信号在细胞质着色,40例PTC中9例(+++),14例(++),3例(+),14例(-),阳性率为65%(26/40),40例PCTT中无(+++)表达病例,2例(++),11例(+),27例(-),阳性率为32.5%(13/40)。与PCTT相比,PTC中VEGF-C蛋白表达率增高,其差异有统计学意义(χ2=26.693, p0.05)。(2)PTC中VEGF-C蛋白表达与患者的性别、年龄以及TNM分期无明显相关(p0.05),而与肿瘤大小、淋巴结转移有关,其差异有统计学意义(χ2=21.626,30.380,p0.05)。 Spearman等级相关分析也显示PTC中VEGF-C蛋白表达水平与患者的性别、年龄的相关性无统计学意义(p0.05),与肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期的相关性有统计学意义(rs=0.405,0.838,0.396,p0.05)。(3)统计分析表明PTC里VEGF-C蛋白表达与DLCl的表达显著负相关,相关性具有统计学意义(rs=-0.739,p0.05)。(4)40例PTC中MLVD平均为11.63土4.19,PCTT组织MLVD平均为4.40±2.50,统计学分析表明PTC肿瘤周边组织中的MLVD显著多于PCTT的MLVD,两者间的差异具有统计学意义(t=9.363,p0.05)。(5)PTC中MLVD与患者的性别、年龄以及TNM分期无明显相关(p0.05),而与肿瘤大小、淋巴结转移有关(χ2=21.897,32.169,p0.05)。(6) Spearman等级相关分析显示PTC中MLVD与VEGF-C的表达水平正相关,相关性具有统计学意义(rs=0.873,p0.05),并且MLVD与DLC1的表达负相关,相关性具有统计学意义(rs=-0.701,p0.05)。 结论:(1)PTC中VEGF-C高表达可能在PTC的淋巴结转移起重要作用并与晚TNM分期相关。(2)PTC中MLVD与淋巴结转移密切相关,肿瘤周边相对较高的MLVD可能在PTC的淋巴道转移中发挥了重要的作用。(3)PTC中DLC1的表达下调或缺失有可能通过上调VEGF-C的表达而促进了PTC中淋巴管的生成。(4)联合检测PTC中DLC1、VEGF-C及MLVD可能有助于预测PTC的转移潜能,对于判断PTC的淋巴结转移可能具有一定的临床价值。


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