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WNT7B在肝细胞癌中的作用及urolithins抗肿瘤机制研究

邱振鹏  
【摘要】:WNT7B为Wingless-Type MMTV Integration Site家族中的一种分泌型信号分子,已被证实在发育及癌症形成过程中具有重要作用。但VNT7B在肝细胞癌中通过调控Wnt/β-catenin信号通路而促进肿瘤发展的机制还不十分清楚。本研究首先通过Western blot方法证实了原发性肝细胞癌组织样本中的WT7B蛋白的异常表达水平,并对WNT7B的mRNA在肝癌细胞系中的表达水平进行定量分析。运用细胞活力(CCK-8),萤光素酶报告实验(Topflash/Fopflash萤光素酶检测系统)及基因表达检测方法研究了Huh-7细胞中外源性WNT7B活化Wnt/β-catenin信号通路并形成信号通路相关的多种细胞应答过程。在HepG2细胞中采用shRNA降低细胞内WNT7B表达后同样证实了WNT7B基因沉默能够弱化细胞自发性Wnt/β-catenin激活状态,并抑制肝癌细胞的侵袭能力。研究还发现WNT7B在肝癌细胞中可能通过与Frizzled4结合而发挥其Wnt通路激活作用。我们还发现了WNT7B能够逆转抗肿瘤药物etoposide在抗癌细胞增殖时对β-catenin的抑制作用。以上结果表明,WNT7B能够活化肝细胞癌中经典Wnt/β-catenin信号通路并调节细胞生物学行为。 Urolithins作为ellagic acid的肠道菌群代谢产物,已被证实具有抑制癌细胞增殖的活性。在这一章节我们研究了Ellagic acid的肠道菌群代谢物urolithin A对肝癌细胞中Wnt信号通路以及urolithin A作用于Wnt通路时对其他通路作用靶点(如P38MAPK及NF-κB等)的影响;我们首先研究了urolithin A通过Wnt信号通路对肝癌细胞系HepG2细胞系存活的影响。通过CCK-8实验检测了0-500μM的urolithin A处理细胞12-36h后的细胞活力。运用PCR及Western blot实验研究了urolithin A对HepG2细胞β-catenin和其它相关因子表达的影响。研究发现,xolithin A能够抑制HepG2细胞的增殖能力,并降低HepG2细胞内TCF/LEF相关的转录激活水平,同时胞内β-catenin、c-Myc及Cyclin D1的表达水平也出现下调。urolithin A还可以激活P53,P38及caspase-3通路,并遏制了NF-κB p65等炎症因子应答。同时,urolithinA能够降低H202诱导的HepG2细胞内的氧化应激水平并上调SOD及GSH-Px活力。 由于urolithin A在肝癌细胞系HepG2的Wnt信号通路抑制作用及对P38相关活性已被证实,我们想进一步研究arolithins对P38MAPK的作用是否在其他肿瘤细胞中具有普遍性。一般而言,药物在体内的分布于药物作用紧密相关。同其他化合物的ADME过程类似,ellagic acid除了其自身少量以原型化合物进入体内外还会通过肠道菌群代谢作用形成rolithins,后者同样经肠壁细胞吸收并进入血液循环,在肝脏发生代谢,最后经过肾小球滤过后在膀胱中积蓄,并排出体外。而urolithins对膀胱癌的治疗作用仍未见报道。本章中我们选取了膀胱癌细胞系作为研究模型,研究ellagic acid及urolithins对膀胱癌细胞T24的增殖抑制作用。本实验中评价了三种rolithins及ellagic acid对膀胱癌细胞系T24的抗增殖作用,发现urolithin A、urolithin B、8-OMe-urolithin A及ellagic acid的ICso值分别为43.9、35.2、46.3和33.7μM。运用rolithins及ellagic acid处理细胞后发现以上4种化合物能够增加P38MAPK的mRNA及蛋白表达,并下调MEKK1及c-Jun的mRNA及蛋白表达水平。同时urolithins使PPAR-y表达量增加,活化caspase-3并诱导细胞凋亡。Urolithins及ellagic acid还能够降低H2O2诱导的T24细胞内氧化应激水平,降低ROS及MDA水平并增加SOD活力。 综上所述,在某些由上游信号分子Wnts介导的Wnt信号活化的肝癌细胞中,干扰肝癌细胞中WNT7B与其受体结合并降低Wnt/β-catenin异常活化状态可能成为一种潜在的肝癌治疗策略;rolithin A能够抑制肝癌细胞增殖并改善细胞内的氧化应激状态,其可能成为ellagitannins经过肠道代谢后在体内发挥肝癌预防及治疗的活性物质;同时,urolithins还能够作用于P38-MAPK和c-Jun,使得caspase-3活化诱导T24细胞凋亡,并降低细胞内氧化应激水平。以上研究为天然多酚类化合物通过Wnt及相关信号通路发挥抗肿瘤作用提供理论研究基础。


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