G9A在人类肝细胞癌中的表达分析及对肝细胞癌细胞增殖和自噬的作用研究

【摘要】：研究目的：G9A是一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶,主要催化组蛋白H3第9位赖氨酸(H3K9)位点。近年来的研究显示G9A在包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)在内的多种肿瘤中表达异常增高,同时也发现在多种肿瘤细胞中降低G9A的表达或抑制其活性可以抑制肿瘤细胞的增殖,并诱导自噬相关的细胞死亡。HCC是我国高发的恶性肿瘤,其死亡率较高,已成为威胁人类生命健康的主要疾病之一。但有关G9A与HCC的细胞增殖和自噬的相关性,目前国内外尚无报道。本课题旨在探讨G9A在HCC中的表达及对HCC细胞增殖和自噬的作用,同时为拓宽G9A抑制剂的临床应用提供一种新思路。研究内容和方法：我们首先选择GEO数据库中与肝细胞癌相关的多个公共数据集进行分析,探索G9A在HCC相关组织中的表达差异,以及评价其在HCC预后中的作用。并利用基因集富集分析(GSEA),预测在HCC中可能受G9A调控的基因集,为进一步研究其在HCC发生发展中的作用提供思路。应用Q-PCR技术检测14对HCC患者肿瘤标本和癌旁正常组织中G9A的表达水平；我们以人肝癌细胞系HepG2和Huh7为研究对象,用G9A的特异性抑制剂BIX-01294分别处理两种细胞,观察不同处理时间对G9A表达水平的影响。显微镜下观察细胞形态,CCK8检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期分布和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。随后我们利用免疫荧光技术检测在BIX-01294作用下自噬标志分子LC3B的表达水平,线性回归分析验证G9A与LC3B的相关性,Western blot检测组蛋白甲基化状态、细胞周期蛋白以及自噬相关蛋白的表达水平。克隆形成实验进一步检测G9A对HCC增殖作用的影响,利用免疫缺陷小鼠模型荷瘤后给予不同浓度BIX-01294处理,观察小鼠的成瘤能力及检测肿瘤大小、体积和重量。研究结果：在GEO四种不同的HCC相关的数据集GSE14520(n=488)、GSE6764 (n=75)、GSE14323 (n=124、GSE50579 (n=80)中,证实G9A在HCC肝癌组织中比在癌旁组织、肝硬化、肝脏不典型性增生组织中表达水平增高(对应p值分别为：p0.001,p0.001,p0.001)；在GSE6764数据集中对肝癌不同病程的分析发现,进展期和晚期HCC比极早期HCC的G9A表达水平增高(p0.01)；HCC临床病理相关性数据分析显示,G9A的表达水平与HCC患者血清AFP水平相关(p0.01),并推测与患者是否发生肝硬化可能相关；G9A高表达的HCC患者术后易复发,且生存期较短；通过GSEA分析证实高表达G9A的HCC样本富集了与细胞增殖、细胞周期相关的基因集。在细胞实验中发现G9A的抑制剂BIX-01294可以影响组蛋白甲基化,显著抑制细胞增殖,将细胞周期阻滞在G1期。用5μMBIX-01294分别处理Huh7和HepG2细胞株24小时后,发现两种细胞的LC3B的表达水平增高；其中Huh7处理48小时后,LC3BI-降低,而LC3B-II的水平增高,诱发自噬性细胞死亡。线性回归分析证实了G9A和LC3B分子之间存在显著性的线性关系,并且呈负相关(p0.05,r=-0.172)。通过克隆形成实验发现,G9A活性受BIX-01294抑制后,HCC细胞的克隆形成能力明显下降,进一步表明BIX-01294可以抑制HCC细胞的增殖能力,推测G9A可能通过其介导的组蛋白甲基化参与了HCC细胞增殖的调控过程。在免疫缺陷小鼠模型体内,HCC具有较高的致瘤性,小鼠随机分组后给予G9A抑制剂BIX-01294分别以0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml剂量处理,发现1.0mg/ml组、2.0mg/ml组肿瘤体积、大小及肿瘤重量均显著减小(p0.05)。同时发现,BIX-01294处理后对HCC荷瘤小鼠的体重没有明显影响。研究结论和意义：本课题发现G9A通过影响肿瘤细胞的增殖、诱发自噬性细胞死亡进而促进肝细胞癌进展。我们的研究表明G9A可以作为临床预后评估的指标及肿瘤治疗的潜在靶点,为G9A抑制剂的进一步临床实验提供了新的依据。