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基于糖基识别和信号放大的元素标记ICP-MS生物医学分析新策略

张星  
【摘要】:多糖是生命体内一类重要的信息分子,参与许多生理、病理过程,如细胞识别、信号传导、炎症发生、肿瘤恶化等。一些糖基化蛋白可作为癌症等疾病的标志物用于临床诊断;细胞表面糖基(如甘露糖、唾液酸等)表达量的变化与肿瘤恶化和转移密切相关;甲型流感病毒表面的糖基在病毒感染宿主细胞的过程中扮演着重要的角色。因此,复杂基质生物样品中糖类化合物的灵敏份析具有重要的意义。近年来,基于元素标记的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术已成为生物分子定量分析中强有力的工具,具有定量方式简单、灵敏度高、基体干扰小、线性范围宽以及可实现多目标物同时分析等优点,在蛋白质、核酸等生物分子检测以及细菌、癌细胞分析等领域得到了广泛的应用。然而,目前将元素标记IC(?)检测方法用于糖类化合物分析的报道还很少,因此有必要开发新型的元素标。ICP-MS方法用于糖类化合物的灵敏分析,以进一步拓展其在生命科学研究中的应用范围。凝集素和硼酸是两类经典的对糖基具有选择性识别作用的分子,其对糖基的亲和作用将有助于实现糖类化合物的元素标记及ICP-MS检测。此外,为了满足生物分析领域中越来越高的对低含量目标物的分析要求,将高效的信号放大策略引入元素标记技术中,进一步提高基于ICP-MS生物分析方法的灵敏度十分必要。纳米金(AuNPs)是一种理想的元素标签,具有生物相容性好、制备和标记方法简单等优点,并且由于单颗纳米粒子中含有成百上千个金原子,因此在ICP-MS检测中具有信号增强的作用。杂交链式反应是一类新型的DNA放大技术,具有高效、简单、无需酶催化和热循环等优点,将其与元素标记ICP-MS技术相结合有望实现分析方法灵敏度的进一步提高。本论文的研究目的是:开发基于糖基识别作用的元素标记糖类化合物的新方法,发展新型信号放大策略用于元素标记以提高方法的灵敏度,拓展元素标记ICP-MS分析方法在生物医学分析中的应用。本论文的主要研究内容包括:(1)发展了一种基于硼酸富集的磁免疫-ICP-MS分析新方法用于两种糖蛋白的同时定量分析。制备了4-巯基苯硼酸功能化的磁珠,可以从复杂样品基质中选择性地捕获糖蛋白,并分别使用AuNPs和纳米银(AgNPs)标记两种糖蛋白对应的抗体用于磁免疫反应,通过ICP-MS同时检测Au和Ag的信号实现了糖蛋白的灵敏分析。以甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)作为两种模型糖蛋白用于磁免疫分析,本方法对AFP和CEA的检出限分别为0.086μgL-1和0.054μL-1,相对标准偏差(n一=7,c=5μg L-1)分别为6.5%和6.2%,线性范围均为0.2-50μgL-1。将本方法用于癌症病人血清样本的分析,获得的结果与临床使用的化学发光免疫分析的结果吻合良好。(2)建立了一种基于硼酸识别的AuNPs标记ICP-MS分析新方法用于癌细胞表面唾液酸的分析。合成了一种“生物素化苯硼酸”化合物,利用苯硼酸与唾液酸在生理pH条件下的特异性识别作用使其与细胞表面唾液酸结合,并通过AuNPs标记的链霉亲和素与生物素的亲和作用,将AuNPs标记于细胞表面作为元素标签,以实现ICP-MS的高灵敏检测。以肝癌细胞(HepG2)和乳腺癌细胞(MCF-7)作为两种模型细胞进行实验,通过自由唾液酸竞争实验得到单个HepG2和MCF-7细胞表面唾液酸分子的平均个数分别为5.4×109和7.0×109。以唾液酸作为癌细胞表面标志物,本方法对HepG2和MCF-7细胞的检出限分别为120和64个细胞,线性范围分别为300-10000和170-11000个细胞,相对标准偏差(n=9,细胞个数为1000)分别为9.6%和8.9%。(3)构建了一种基于AuNPs标记和杂交链式反应(HCR)的双重放大策略用于元素标记,结合ICP-MS检测实现了循环肿瘤细胞(CTCs)的灵敏分析。制备了抗上皮细胞粘附因子抗体(anti-EpCAM)偶联的磁珠用于从外周血中选择性捕获CTCs,通过HCR得到生物素修饰的DNA串联体,并利用链霉亲和素与生物素的作用将AuNPs标记于DNA串联体上制备了标记探针(AuNPs标记的DNA串联体),用于目标细胞的元素标记和ICP-MS检测。以肝癌细胞HepG2作为模型细胞用于磁免疫分析,本方法对HepG2细胞的检出限低至15个细胞,线性范围为40-8000个细胞,相对标准偏差(n=7,细胞个数为200)为8.7%。将所建立的方法用于人血液样本中HepG2细胞的加标实验,获得了良好的结果,表明本方法可用于实际血样的分析。(4)建立了一种基于凝集素识别和双重信号放大策略的元素标记ICP-MS分析新方法用于H9N2病毒的灵敏检测。利用伴刀豆凝集素(Con A)对病毒糖蛋白的亲和识别作用实现了元素标记,并通过AuNPs标记和HCR的双重信号放大提高了ICP-MS检测的灵敏度。制备了抗H9N2病毒血凝素抗体(anti-H9N2 HA)偶联的磁珠对复杂基质样品中的病毒H9N2进行选择性捕获,并且以Con A为桥梁实现了含有甘露糖“头部”的AuNPs标记DNA串联体对H9N2病毒粒子的标记并用于ICP-MS检测。本方法对H9N2病毒粒子的检出限为0.12 μg L-1,线性范围为0.4-50μL-1,相对标准偏差(n=7,c=2μg L-1)为7.9%。将所建立的方法用于鸡粪提取液样品中H9N2病毒的加标实验,验证了本方法在实际样品分析中的应用潜力。


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