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趋化因子CXCL12/CXCR4/CXCR7轴在胎盘中的表达模式及其在子痫前期滋养细胞凋亡机制的研究

卢静  
【摘要】:子痫前期(preeclampsia, PE)是妊娠期特有的疾病,以妊娠20周以后首次出现高血压、蛋白尿、水肿为主要特征,并可伴有全身多脏器的损害。病情严重者可因抽搐、脑出血、肺水肿、心功能衰竭、弥漫性血管内出血而导致死亡。尽管关于子痫前期的研究很多,但其发病机制仍然不清楚。由于缺乏特异性的生物学指标和有效干预措施,使得子痫前期仍然是影响孕产妇死亡和围生儿发病的重要原因之一。趋化因子CXCL12,又称基质细胞衍生因子-1(Stroma cell derived factor 1, SDF-1)表达于许多组织中,如心脏、肝脏、肾、脑和骨髓中等。CXCL12是造血干细胞动员和归巢的关键因子,同时在免疫细胞活化、迁移,肿瘤细胞侵袭转移和胚胎生长发育等过程中起着关键的作用。既往认为趋化因子受体CXC--R4 (Chemokine receptor 4, CXCR4)是CXCL12的唯一受体,越来越多的证据表明CXCL 12还存存另外一个受体CXCR7 (Chemokine receptor 7, CXCR7). CXCR7不仅形式上与CXCR4形成异源二聚体,募集β抑制蛋白,介导相关信号通路,而且还可以独立地与CXCL12结合介导细胞内信号转导。CXCR7与CXCL12的亲和力高于CXCR4并且具有“清道夫”的功能。课题组前期的关注点主要集中在趋化因子CXCL 12/CXCR4/CXCR7轴在早孕期母胎界面免疫微环境的生物学功能。本课题拟在前期的工作基础上,建立人足月胎盘滋养细胞体外(Trophoblast cells, TCs)分离培养体系,分析CXCL12/CX--CR4/CXCR7轴在晚孕胎盘滋养细胞中的表达模式及其生物学功能,分析CXCL12/CXCR4/CXCR7与子痫前期胎盘滋养细胞凋亡的关系,探索CXCL 12/ CXCR4/CXCR7轴在子痫前期发病中的作用,为日后临床防治工作提供新的思路。第一部分人足月胎盘滋养细胞体外分离培养及鉴定目的:建立一种经济、高效的人足月胎盘滋养细胞分离培养方法,为后续实验奠定基础。方法:收取正常足月患者剖宫产后的胎盘组织,经DNAI酶联合胰酶反复消化、网筛过滤、不连续密度梯度分离液分离纯化细胞;应用免疫细胞化学法鉴定细胞纯度;CCK-8法(Cell Counting Kit 8,细胞增殖与毒性试剂盒)和Tran swell实验对细胞的体外生长活力和侵袭能力进行检测。结果:成功分离出人足月胎盘滋养细胞。50g组织中可获得大于1×107个细胞。体外培养时在倒置相差显微镜下观察,细胞种板后3h卡始贴壁,24h后逐渐开始融合。免疫细胞化学法结果显示,上皮来源的滋养细胞表达角蛋白7(Cytokeratin 7, CK7),不表达波形蛋白(Vimentin),细胞纯度可达90%以上。CCK-8结果显示足月胎盘滋养细胞在体外增殖能力较弱,72h内细胞不能成倍增殖。Transwell侵袭实验结果显示,足月胎盘滋养细胞在体外培养有一定的侵袭能力。结论:本研究改进了既往足月胎盘滋养细胞原代培养的方法,简化操作步骤,缩短操作时间,并且一次性可获得大量且纯度活力较好的胎盘滋养细胞。第二部分CXCL12/CXCR4/CXCR7轴在正常人足月胎盘滋养细胞的表达模式目的:解析趋化因子CXCL12及其受体CXCR4/CXCR7在正常人足月胎盘滋养细胞的表达情况,探索CXCL12/CXCR4/CXCR7信号通路在正常人足月胎盘滋养细胞的生物学功能。方法:胎盘标本取自中南医院妇产科住院足月分娩的正常孕妇。应用免疫组织化学法检测CXCL12/CXCR4/CXCR7在胎盘组织中的表达情况;按第一部分方法进行细胞培养,免疫细胞化学法检测原代滋养细胞中CXCR4/CXCR7/CX--CL12的表达情况;流式细胞术分析原代滋养细胞总CXCR4与CXCR7的表达水平;Real-time PCR分析原代滋养细胞中CXCR4/CXCR7/CXCL12的mRNA水平。同时,设计分组分别为添加重组人CXCL12 (100ng/ml)、重组人CXCL12+CXCR4中和抗体(20μg/ml)、重组人CXCL12+CXCR7中和抗体(10μg/ml)、重组人CXCL12+CXCL12,和抗体(25μg/ml),应用CCK-8试剂盒检测添加不同处理因素后滋养细胞的体外增殖能力;应用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测人足月胎盘滋养细胞的培养上清中分泌CXCL12的水平。结果:免疫组织化学和免疫细胞化学结果显示,CXCL12、CXCR4、CXCR7三种蛋白在胎盘组织滋养细胞中均表达,胞浆和胞膜均可见棕黄色染色。利用Image-Pro Plus 6.0软件进行光密度分析,CXCL12染色平均光密度值(0.12±0.06),低于CXCR7(0.20±0.01),低于CXCFR4染色平均光密度值(0.23±0.02),CXCR4与CXL12比较差异有统计学意义(P0.05)。流式细胞术结果提示:滋养细胞膜CXCR4平均表达水平为:9.23±8.23%,CXCR7为:4.56±3.24%,两者比较差异有统计学意义(P0.05);Real-time PCR结果与ICC类似。CCK-8检测hCXCL12对滋养细胞体外培养增殖力的影响,发现外源性添加rhCXCL12对细胞增殖力有一定的促进作用,且分别添加CXCL12、CXCR4或CXCR7中和抗体,可以不同程度地抑制这种促进作用,数据有统计学差异(P0.05)。ELISA结果显示足月胎盘滋养细胞体外培养可分泌CXCL12,但分泌CXCL12的能力并不随时间呈累计效应,添加中和抗体处理后,CXCL12的分泌水平有变化,添加CXCR7中和抗体组与对照组相比,差异有统计学意义(P0.05),但是添加CXCR4或CXCL12中和抗体组与对照组相比,差异无统计学意义(P0.05)。结论:正常足月胎盘滋养细胞存在CXCL12/CXCR4/CXCR7共表达,趋化因子CXCL12/CXCR4/CXCR7在晚孕期发挥着一定的生物学功能。第三部分CXCL12/CXCR4/CXCR7轴在子瘸前期滋养细胞凋亡机制的初探目的:解析CXCL12/CXCR4/CXCR7轴在子痫前期滋养细胞中的表达模式,探讨趋化因子CXCL12/CXCR4/CXCR7与子痫前期滋养细胞凋亡的相关性,为进一步研究滋养细胞凋亡在子痫前期发病机制中的信号转导通路提供线索及切入点。方法:收集50例胎盘标本,其中轻度子痫前期胎盘组织11例、重度子痫前期胎盘组织18例、正常胎盘组织21例。透射电镜观察胎盘组织的超微结构。TUNEL实验检测正常胎盘与子痫前期胎盘的凋亡情况;免疫组织化学法分析CXCL12/CXCR4/CXCR7在三组胎盘组织的表达;免疫细胞化学法检测CXCL12/CXCR4/CXCR7在子痫前期滋养细胞中的表达模式;流式细胞术、Real-time PCR和Western blot比较正常滋养细胞与子痫前期滋养细胞中CXCL12/CXCR4/CXCR7的表达差异。流式细胞术检测添加不同处理因素(处理同第二部分)对滋养细胞的凋亡的影响。结果:电镜下观察重度子痫前期患者胎盘滋养细胞具有明显的凋亡倾向;TUNEL实验结果显示正常组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组凋亡率呈递增趋势。重度子痫前期组与轻度子痫前期组,轻度子痫前期组与正常组差异无统计学意义(P0.05),重度子痫前期组与正常组比较差异有统计学意义(P0.05)。IHC和ICC结果显示CXCL12, CXCR4、CXCR7在子痫前期胎盘组织和原代滋养细胞中均有明显的阳性表达。流式细胞术结果提示:从重度子痫前期胎盘滋养细胞中的CXCR7 (4.33±3.62%), CXCR4 (2.23±1.10%),两者的含量均低于正常组,但无统计学差异(P0.05); Real-time PCR和Western blot检测结果显示CXCL12、CXCR4、CXCR7在重度子痫前期胎盘滋养细胞中mRNA和蛋白水平均低于从正常胎盘滋养细胞。流式细胞术结果显示外源性添加重组人CXCL12可以降低滋养细胞的凋亡率,而添加CXCR4、CXCR7或CXCL12中和抗体后能不同程度地减弱这种作用。结论:子痫前期胎盘滋养细胞中CXCL12、CXCR4、CXCR7表达异常,可能是导致滋养细胞凋亡增加,继而引起子痫前期发病的的原因之一。


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