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纤溶酶QK与单链胰岛素类似物SCI-59分别在乳酸菌中的表达及活性分析

毛瑞峰  
【摘要】:乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)广泛的分布于绝大多数的动物包括人体的肠道内且具有非常悠久的为人类所食用的历史。其中许多菌株细胞已被赋予具有安全性、益生性的特点,因此这些乳酸菌菌株可以来作为抗原分子、功能蛋白或DNA分子的黏膜递送载体。随着乳酸菌基因组学的发展以及其遗产操作系统的不断丰富,通过构建重组乳酸菌分泌表达或表面展示外源抗原或其他功能蛋白后,不经纯化等复杂步骤,直接口服重组菌体细胞的方式作为口服疫苗或药物的研究越来越受到重视。本论文主要采用乳酸菌分泌表达了枯草杆菌蛋白酶QK以及单链胰岛素类似物SCI-59,并且利用乳酸菌自溶素AcmA蛋白的锚定结构域LysM重复片段分别将两种蛋白展示到了不具生物活性的乳酸菌细菌性微粒(bacterial-like particles,BLPs)的表面。溶栓疗法是目前血栓栓塞性疾病的主流治疗手段,其中微生物是多种溶栓剂的重要来源。分离自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis QK02)发酵液中的枯草杆菌蛋白酶QK是一种具有巨大应用潜力的高效溶栓剂,但枯草杆菌发酵过程中产生的不友好气味以及需要经过复杂的提取步骤得到纯化蛋白等严重限制了其在溶栓市场上的广泛应用。通过利用乳酸菌对其进行分泌表达或表面展示,将会提高其应用程度。胰岛素在药物治疗糖尿病中处于十分重要的地位,作为目前最主要的给药方式,皮下注射胰岛素在治疗疾病的同时,也将会引起非常严重的副作用。与注射方式相比,口服胰岛素则更容易受糖尿病患者接受且不会引起较大的副作用,但由于在胃肠道内的降解效应导致经口服后的胰岛素具有较低的利用率。为了利用食品级乳酸菌细胞作为胰岛素的口服呈递载体,在人胰岛素B链与A链之间引入一条八氨基酸连接短肽而形成单链胰岛素(single-chain insulin,SCI)类似物SCI-59。利用乳酸菌分泌表达或表面展示具有生物活性的SCI-59将会为口服降糖药物的开发提供新的可能。本论文利用乳酸菌分别成功的分泌表达和表面展示了 QK与SCI-59,研究结果主要分为以下两个部分:1.利用乳酸菌nisin诱导表达系统(nisin controlled expression system,NICE)成功的分泌表达与表面展示了具有溶栓活性的QK。在启动子PniA与分泌信号肽SPusp的驱动下,QK成功的分泌至发酵上清液。在使用不同筛选策略的NZ9000与NZ3900重组工程菌中,其分泌表达量无明显差异,但在NZ3900重组菌中出现了遗漏表达(leaky expression),而在NZ9000重组菌中没有此现象。在发酵过程中通过一次性添加NaOH来调节培养基pH使其在弱碱性环境会提高发酵培养基中的单位纤溶活性。通过对QK编码全序列以及仅前导肽序列进行乳酸菌密码子偏好性优化都可以明显的提高表达上清液所具有的单位纤溶活性。通过将QK编码基因序列与AcmA蛋白中不同数目的LysM重复片段编码基因进行融合,利用乳酸乳球菌NICE表达系统,成功得到了不同的QK/LysM融合蛋白。其中融合到QK蛋白C端的3个LysM片段形成的QK-3LysM融合蛋白在保持QK纤溶活性的同时具有最强的与不同LAB BLPs结合的能力。与分泌得到的游离QK相比,通过LysM结构域结合到LAB BLPs表面的QK在模拟胃液中具有更高的稳定性,表明BLPs可以为其提供一定的保护作用。2.根据单链胰岛素类似物设计原理,在人胰岛素AB两条链之间引入了八个氨基酸残基(RSRGLPFR),并将其编码基因进行了乳酸菌密码子偏好性优化得到sci-59。利用乳酸菌NICE表达系统,成功分泌表达与表面展示了具有与成熟脂肪细胞表面胰岛素受体相结合并刺激其完成Akt信号转导的单链胰岛素类似物SCI-59。在诱导开始3 h时通过一次性加入NaOH调节培养基pH会明显提高有功能活性SCI-59蛋白的含量。利用3个LysM片段融合到SCI-59的C端得到的SCI-59-3LysM融合蛋白可以结合到不同LAB BLPs表面,并且能够将SCI-59进行充分的暴露,对其与脂肪细胞表面胰岛素受体的识别与结合作用影响较小。与游离状态下的SCI-59以及人胰岛素相比,通过LysM结构域结合到LAB BLPs表面的SCI-59在模拟胃液中具有更高的稳定性,表明BLPs可以有效的减少其在经过胃肠道时的降解效应。本论文中,利用乳酸菌分别分泌表达和表面展示了具有相应功能活性的QK与SCI-59。对于分泌表达,可以通过口服重组工程菌,并且在其于体内定植期间可以持续的分泌表达目的蛋白;而对于表面分别展示有QK与SCI-59的LAB BLPs可以在口服后经过胃肠道时为其提供一定的保护作用,可以提高两种功能蛋白的口服利用率。通过乳酸菌作为QK与SCI-59的口服递送载体,分别为开发口服溶栓与降糖药物提供了新思路。


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