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长链非编码RNA-MALAT1在芬太尼预处理减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用

赵智慧  
【摘要】:背景:心血管疾病再灌注治疗手术,如经皮冠状动脉腔内成形术、冠状动脉搭桥术、心肌梗死病人的溶栓治疗等,已广泛应用于临床,显著改善了患者的预后。然而,再灌注治疗在迅速恢复缺血心肌的血液供应以挽救濒死心肌的同时,也会引起心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI),导致心脏功能的紊乱,如心律失常、心肌顿抑、微血管堵塞等,严重影响患者健康。心肌缺血预处理(ischemicpreconditioning,IPC)是一种有效的内源性心肌保护机制,然而其临床使用存在一定局限性。因此,探索有效模拟药物并结合相应药物的分子靶标,将为临床心肌缺血再灌注损伤的保护治疗提供新的机遇。已有研究证实,阿片类药物芬太尼预处理在心肌缺血再灌注损伤过程中具有与IPC相似的心肌保护作用。然而,其具体的分子机制尚未完全阐明。细胞凋亡在心肌MIRI中扮演着重要的角色。那么,芬太尼预处理是否可以通过抑制心肌细胞凋亡而减轻再灌注损伤?其具体分子机制如何?有待进一步研究。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)-MALAT1在调控心血管疾病方面已有初步研究,其表达下调可以减少心肌细胞凋亡。然而lncRNA-MALAT1是否参与芬太尼预处理对再灌注心肌的保护作用尚无相关研究。lncRNA作为一个调控分子,在多种病理刺激下其表达发生变化,通过上调或下调miRNA的水平,进而影响miRNA靶向基因的表达,从而参与调节病理发生发展过程。已有研究指出,miR-145可以通过靶向调控心肌细胞凋亡相关分子Bnip3的表达,抑制过氧化氢所致的心肌细胞凋亡。目的:本研究旨在探讨lncRNA-MALAT1调控的miR-145/Bnip3信号通路在芬太尼预处理减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用。方法:第一部分:以小鼠HL-1心肌细胞缺氧/复氧模型为基础,给予芬太尼预处理,通过荧光定量PCR检测lncRNA-MALAT1、miR-145和Bnip3 mRNA表达以及western blot检测Bnip3蛋白的表达,探讨在心肌细胞缺氧/复氧条件下,芬太尼预处理对lncRNA-MALAT1、miR-145和Bnip3表达的影响。第二部分:在小鼠HL-1心肌细胞中进行lncRNA-MALAT1的过表达及沉默,通过荧光定量 PCR 或者 western blot 检测 miR-145、Bnip3 mRNA 以及 Bnip3、LC3-I、LC3-II、Beclin-1 的蛋白表达,观察 lncRNA-MALAT1 对 miR-145 和 Bnip3蛋白的调控作用。第三部分:1)以小鼠HL-1心肌细胞缺氧/复氧模型为模型,给予芬太尼预处理,再进行lncRNA-MALAT1的过表达或者miR-145抑制剂修饰,通过ELISA法检测乳酸脱氢酶(LDH)含量,TUNEL法检测细胞凋亡,确定MALAT1过表达/miR-145抑制对芬太尼心肌保护作用的影响;2)以小鼠HL-1心肌细胞缺氧/复氧模型为模型,再进行lncRNA-MALAT1的沉默,通过荧光定量PCR或者western blot 检测 miR-145、Bnip3 mRNA 以及 Bnip3 蛋白表达,观察lncRNA-MALAT1对miR-145/Bnip3信号通路的调控作用;第四部分:雄性C57BL/6小鼠被随机分成5组:假手术组、心脏缺血再灌注模型组、芬太尼预处理+心脏缺血再灌注治疗组、芬太尼预处理+心脏缺血再灌注治疗组+Ad-GFP、芬太尼预处理+心脏缺血再灌注治疗组+Ad-MALAT1。收集各组血清检测LDH含量,确定MALAT1过表达对芬太尼心肌保护作用的影响。结果:第一部分:荧光定量PCR和western blot结果显示,缺氧/复氧引起心肌细胞中lncRNA-MALAT1表达上调、miR-145表达下调、Bnip3 mRNA和Bnip3表达上调;而由缺氧/复氧引起的lncRNA-MALAT1、miR-145和Bnip3表达变化均被芬太尼所逆转。第二部分:MALAT1过表达导致miR-145的表达下调、Bnip3表达上调。MALAT1抑制表达引起miR-145的表达上调、Bnip3表达下调。第三部分:在缺氧/复氧的HL-1心肌细胞中,由芬太尼引起的miR-145表达上调和Bnip3表达下调效应均被MALAT1过表达所逆转;由缺氧/复氧引起的HL-1心肌细胞中miR-145表达下调和Bnip3表达上调效应均被MALAT1抑制表达所逆转。MALAT1过表达可逆转芬太尼的心肌保护功能和抗心肌细胞凋亡效应;同样,miR-145抑制剂也可逆转芬太尼的心肌保护功能和抗心肌细胞凋亡效应。第四部分:在小鼠心肌缺血再灌注模型中,MALAT1过表达逆转了芬太尼的心肌保护作用,促进血清LDH释放。结论:1.心肌細胞缺氧/复氧可引起MALAT1表达上调,而MALAT1的这种表达上调的效应可被芬太尼抑制。2.在心肌细胞或者心肌细胞缺氧/复氧模型中,MALAT1负向调控miR-145的表达,而与Bnip3的表达趋势一致。3.MALAT1过表达或者miR-145表达抑制均可以逆转芬太尼预处理的心肌保护作用和抗心肌细胞凋亡效应。4.MALAT1/miR-145/Bnip3信号通路参与芬太尼预处理减轻心肌缺血再灌注损伤的过程。


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