基于CRISPR/Cas9技术的抗HIV-1新策略和急性髓系白血病抗药性机制研究

【摘要】：精确的基因修饰可在细胞的水平上实现疾病的精准预防和治疗,研究者通过基因编辑技术敲除疾病相关的基因,矫正发生突变的基因或者插入一个保护性的基因来实现这一目的。目前高效联合抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antiretroviral Therapy,HAART)是获得性免疫缺陷综合征即艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)的主要治疗方式。此种疗法虽然可以有效的控制病人病情发展并可延长病人寿命但其不能清除已感染并长期潜伏的病毒也无法彻底治愈艾滋病;而且药物依赖性强,价格昂贵,长久服用会造成抗药性。至今为止还没有有效的针对HIV-1的疫苗,因此,艾滋病治疗的新方法亟待研发。本研究目的之一为利用CRISPR/Cas9敲除人免疫缺陷病毒(HIV-1)的细胞辅助受体,以期获得抗HIV-1感染的人免疫细胞,为艾滋病的基因治疗奠定基础。著名的柏林病人(Berlin patient)事件使越来越多的研究者将目光放在了艾滋病的基因治疗上,以期能够通过体外改造获得抗HIV-1感染的细胞,再将体外编辑的细胞回输到病人体内从而达到抗病毒感染治疗。CRISPR/Cas9系统利用一小段与靶点互补的RNA将Cas9核酸酶带到靶位点区切割双链DNA,造成基因的双链断裂(DSB)从而阻断基因的正常表达。该技术被认为是一种效率高且高度可靠的技术,在活细胞中可实现基因的精确修饰。本研究利用CRISPR/Cas9系统特异性地敲除HIV-1入侵受体细胞所需的辅助受体CXCR4。在我们设计的10个sgRNAs中,5个sgRNAs可以检测到基因编辑效应,其中两个sgRNAs可以高效地阻断CXCR4的表达。我们在模式细胞Ghost细胞、Jurkat T细胞以及人和恒河猴的原代CD4+ T中实现了高效率的CXCR4基因敲除,被基因敲除的细胞可以有效地抵抗HIV-1的感染。而且在我们的研究中并未发现明显的脱靶效应。本研究为AIDS基因治疗提供了一定的依据和基础,展示了 CXCR4作为AIDS基因治疗靶标的前景。CRISPR/Cas9系统基因编辑的高效率及可同时靶向不同基因或者同一基因不同位点的特性使得该系统可应用于高通量全基因组水平上的筛选。传统的RNA干扰技术只能短暂地且不彻底地敲低基因的表达水平,脱靶率较高且受限制于转录的基因DNA,而CRISPR/Cas9系统联合sgRNA文库在筛选中效率高,灵敏度强,而且基因敲除彻底并可用于几乎所有DNA序列的编辑。FMS-like tyrosine kinase 3(FLT3)的激活突变是在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia;AML)中最常见的一种分子突变类型,该基因的突变也被视为是一种不良预后诊断信号。Quizartinib(AC220)是FLT3的第二代抑制剂,与第一代激酶抑制剂相比,它的效果更好,特异性更强,可用于易反复发作或难以治愈的AML病人的治疗,现在已进入二期临床试验阶段。癌症化学药物治疗的一个普遍问题是易于产生抗药性,因此本研究的目的之二是使用CRISPR/Cas9技术进行全基因组范围的无偏差的抗药性筛选,以期鉴定AML抗药性相关的基因,为进一步改善AML治疗效果提供理论依据。本研究利用针对人的CRISPR/Cas9二代文库在急性白血病AML细胞MV4-11中进行了抗药性筛选。我们发现一些基因被敲除后会造成白血病细胞对AC220的抗药性。和野生型细胞相比,基因敲除的细胞显示了对AC220耐受性显著增强。我们选择了 FGF-ERK信号通路的抑制因子SPRY3和经典Wnt信号通路的抑制因子GSK3做进一步验证,在AML细胞系以及原代细胞中分别敲除这两个基因都使得原本对于AC220敏感的细胞产生了抗药性。SPRY3和GSK3基因敲除的MV4-11细胞的IC值分别约为8 nM和6 nM,而野生型细胞的IC值仅为2 nM。我们对病人样本的分析发现对于AC220药物不敏感或者接受药物治疗效果较差的病人的SPRY3和GSK3的表达水平显著高于对AC220敏感的病人。药理学实验也表明我们的研究为AML治疗药物的筛选以及抗药性机制的研究提供了新的思路,并在此基础上为改进AML的治疗提供新的技术和理论支持。