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蒙古族任娠糖尿病患者肠道菌群的结构特征及其与代谢、炎症的相关性研究

张洁  
【摘要】:妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitusGDM)被列为糖尿病的一个独立分型,其发病率逐年升高,目前认为可能与遗传、环境、免疫等因素有关。近年来大量研究显示肠道菌群作为环境因素可能参与了糖尿病的发生。研究者们通过基因组测序的方法揭示糖尿病患者肠道菌群的组成、丰度等,并在动物体内进行验证,明确和疾病相关的细菌功能。研究发现,2型糖尿病(T2D)患者肠道菌群结构发生显著变化,多数来自条件致病菌,例如:粪便拟杆菌属,hathewayi梭菌,多枝梭菌,共生梭菌,迟缓埃格特菌,大肠杆菌;而健康对照组的粪便样本中产生的几乎所有宏基因组菌种都来自产丁酸盐细菌,包括:梭菌属,直肠真细菌属,柔嫩梭菌属,肠罗氏菌属和Roseburiainulinivorans等。除了 T2D,1型糖尿病(T1D)儿童的肠道菌群分布也是失衡的,某些菌群的比例发生变化,如放线菌门/厚壁菌门、厚壁菌门/拟杆菌门的比例是降低的,某些有益菌群如产生丁酸盐的细菌含量减少。但目前关于GDM患者肠道菌群结构的研究数据很少。研究发现,蒙古族人群糖尿病的患病率明显低于全国患病率。同时,肠道菌群与种族有关。故本文将种族与GDM结合,重点研究蒙古族GDM患者肠道菌群结构特征的变化。另外,GDM常伴有炎症过程及代谢异常。目前的研究认为白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为前炎症因子,在GDM及胰岛素抵抗(IR)的发展过程中起到调节作用。GDM的糖、脂代谢因子及炎症因子均与GDM密切相关。故本文对蒙古族GDM血清部分炎症因子及代谢指标进行检测,并为后期与肠道菌群的相关性研究奠定基础。研究发现:T2D群体中丰度增加的乳酸菌属和空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)呈正相关。对比丰度减少的梭菌属与FBG、HbA1c、空腹胰岛素(FINs)、C肽和甘油三酯(TG)呈负相关,与脂联素、高密度脂蛋白(HDL)呈正相关。因此,本文选取蒙古族GDM患者部分血清代谢指标、炎症因子与对比丰度有差异的菌种进行相关性研究,旨在明确蒙古族GDM患者肠道菌群的潜在致病机制。本文使用最新的三代测序技术,即PacBio公司的单分子实时(SMRT)测序平台,将读长1500bp的16SrRNA片段完整测出,无需数据组装,错误率低,所得的实验结果更可靠。此外,第三代PacBio SMRT测序技术能够将细菌类群在属和种的水平上精确分类,且所测物种数量比二代测序技术更多,因此优势显著。第一部分蒙古族、汉族GDM患者肠道菌群的16SrRNA三代测序分析目的:对比蒙古族、汉族GDM患者肠道菌群的结构特征,找到有丰度差异的菌种,明确其是否与蒙古族糖尿病患病率低有关。然后再将蒙、汉族GDM合并为疾病组,与健康对照组进行对比,明确其肠道菌群结构的差异。方法:研究共纳入研究对象114例,分为4组,分别为:1组(蒙古族GDM组)18例、2组(汉族GDM组)29例、3组(蒙古族妊娠正常组)32例和4组(汉族妊娠正常组)35例。按照纳入标准收集研究对象的新鲜粪便标本。提取粪便宏基因组DNA,扩增其16SrRNA全长片段,并使用第三代测序法(PacBio SMRT测序平台)进行测序,最后通过生物信息学分析明确其肠道菌群的结构特征。结果:1、人口学数据及临床资料显示:1组的年龄、身体质量指数(BMI)、TG、FBG、HbA1c与2组之间无统计学差异(P值均0.05)。2、肠道菌群检测结果总体分析:最终共纳入82例粪便样本,通过PacBio SMRT测序,共获得有效序列387699条,平均每个样本序列数为4728条。使用Uparse软件将相似度大于98.65%的序列聚类后共获得17218个操作分类单元(OTUs)。以3102条为统一量进行抽平,得到抽平后的OTUs总数为15780个,平均每个样品的OTUs数为192个。3、Alpha多样性分析中的稀释曲线显示,随着测序量的不断增加,四组样本的稀释曲线均趋于平缓;1组的OTUs数、chao1指数、shannon指数均明显高于2组,统计学差异具有显著性(P0.05);1组的OTUs数、chao1指数也明显高于3组,统计学差异具有显著性(P0.05)。4、Beta 多样性分析中的主坐标分析(principal CO-ordinates analysis,PCoA)显示,在代表82个样本的散点图的PC1-PC2坐标系中,四组样本多数重叠,未明显区分开来。聚类分析显示部分样品首先在本类样品中实现聚类,再与其他样本或聚类进一步合并,两组间有不同程度的重叠。5、分类学分析中的LEFSe分析显示:1组与2组的肠道菌群分别在门、纲、目、科、种水平上存在差异,具体表现为1组的疣微菌门(Verrucomicrobia)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)的丰度均明显升高(P均0.05),而Ruminococcus sp.YE78的丰度在1组明显降低(P值=0.029)。6、1、2合并组(GDM组)和3、4合并组(妊娠正常组)比较,发现肠道菌群在门、属、种水平上存在差异。其中种水平有3种,表现为GDM组的bacteroides fragilis、paraclostridium bifermentans、sutterella wadsworthensis3 个菌种的丰度均高于妊娠正常组,且具有统计学意义(P值分别为0.0441、0.0229、0.0450)。结论:1、蒙古族GDM患者肠道菌群结构优于汉族GDM,多数为不易导致糖尿病的菌种,推测蒙古族人群肠道菌群的优势可能是其糖尿病发病率低的原因之一。但由于瘤胃球菌属的作用目前仍存在争议,而且肠道菌群的微生态过于复杂,不能仅通过一两类菌属(种)就下定论,因此有待进一步研究。2、GDM患者存在肠道菌群失调,条件致病菌增多。3、本文在种水平上发现了实验组与对照组之间菌种的差异性,显示出第三代测序技术的优势。第二部分蒙古族GDM患者代谢及炎症情况的研究目的:检测蒙古族GDM患者与蒙古族正常妊娠妇女的血清代谢指标与炎症因子,并进行统计学差异分析,为下一步与肠道菌群的相关性研究奠定基础。方法:从60例蒙古族GDM孕妇及60例蒙古族正常妊娠妇女中采集血液样本(包括第一部分的18例蒙古族GDM患者),于呼和浩特市第一医院检验科检测代谢指标,使用Bio-PlexProrM试剂盒检测炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10、及 TNF-α。结果:从临床特征来看,与蒙古族正常妊娠妇女相比,蒙古族GDM患者年龄较大、有较高的BMI指数,低初产妇占比、有2型糖尿病家族史及GDM病史(p均0.05)。血清炎症因子:IL-6、IL-6/IL-10比率在两组孕妇之间的差异均具有统计学意义(P均0.05)。两组血清中的代谢指标:FBG、FINS、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛β细胞功能指数(HOMA-β),具有统计学差异(P 值均0.05)。结论:蒙古族GDM患者血清炎症因子和糖脂代谢指标存在表达异常,炎症及糖代谢、脂代谢失常与蒙古族GDM存在密切联系。它们之间的关系值得更深入的研究。第三部分蒙古族GDM患者肠道菌群与代谢、炎症的相关性研究目的:通过第一部分和第二部分得到的实验结果,选取蒙古族GDM的差异菌种及部分血清代谢指标及炎症因子进行相关性研究。差异菌种选取:疣微菌门(Verrucomicrobia)和瘤胃球菌属的Ruminococcussp.YE78菌种。代谢指标及炎症因子选取:FBG、FINs、TG、IL-6、TNF-α。方法:使用SPSS22.0统计软件,对蒙古族GDM的差异菌种与血清代谢指标、炎症因子进行spearman相关分析。P0.05为差异有统计学意义。结果:蒙古族GDM患者的疣微菌门(Verrucomicrobia)丰度与其FINs、TG、HbA1C均呈负相关,相关系数分别为-0.870、-0.732、-0.686,且具有统计学意义(P=0.000,0.001,0.002),与 FBG、IL-6、TNF-α无显著相关(P 均0.05)。瘤胃球菌属-Ruminococcus sp.YE78菌种的丰度与FBG呈正相关,相关系数为0.666,且具有统计学意义(P=0.004),与 FINs、TG、HbA1C、IL-6、TNF-α均无显著相关(P均0.05)。结论:蒙古族GDM患者比汉族GDM显著升高的疣微菌门丰度与FINs、HbA1C、TG均呈负相关:显著降低的Ruminococcus sp.YE78菌种的丰度与FBG呈正相关。支持了蒙古族GDM患者肠道菌群结构优于汉族GDM的结论,推测蒙古族人群肠道菌群的优势可能是其糖尿病发病率低的原因之一。但由于肠道菌群的微生态过于复杂,不能只通过一两类菌属(种)就下定论,因此有待进一步研究。


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