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解脂耶氏酵母促进菌丝形成转录因子Mhy1的启动子、靶基因及结合位点的鉴定

吴恒  
【摘要】:一些种类的真菌能够在卵圆形的酵母形态与丝状的菌丝形态之间相互转换,这称为二型性转换,这一过程可被多种环境因素所诱导,包括温度、pH、碳源的可利用情况及一些特殊的营养物质等。二型性转换被认为是真菌应对营养匮乏等环境压力的一种应答反应。二型性转换调控机制的研究对于揭示真菌如何适应环境具有重要的科学意义,对于二型性病原真菌的预防及治疗也具有重要的指导作用。解脂耶氏酵母是一种无致病性的非传统型酵母,能够以烷烃、脂肪酸和油脂作为唯一碳源生长,具有良好的脂质降解及代谢产物分泌能力,在工业生产上具有广泛的应用。在进化上,解脂耶氏酵母与酿酒酵母和白色念珠菌亲缘关系较远,但是同酿酒酵母与白色念珠菌相似,也能在一些环境因子(如氮源缺乏、血清、中性pH等)的诱导下发生二型性转换,我们对它的二型性转换过程很感兴趣,希望能够揭示其调控机制。锌指转录因子在真核生物中广泛存在,其中,Msn2/4家族C_2H_2型锌指转录因子在酿酒酵母中通过结合下游靶基因启动子中的STRE,调控一系列靶基因的转录表达,在压力抵抗、糖酵解及脂肪酸代谢等方面发挥着重要的调控作用。白色念珠菌中Msn2/4家族成员Mnl1在弱酸抵抗中发挥作用。解脂耶氏酵母中Msn2/4家族成员Mhy1参与对二型性转换的调控,而酿酒酵母Msn2/4和白色念珠菌Mnl1均不调控该细胞学功能,显示出Mhy1在细胞学功能上与其它Msn2/4家族成员存在差异。我们对解脂耶氏酵母的Mhy1及其同源蛋白YlMsn4进行研究,通过基因敲除与过量表达,鉴定了这两个锌指转录因子的细胞学功能。发现Mhy1对解脂耶氏酵母的菌丝形成具有重要的促进作用,Mhy1缺失后细胞丧失菌丝形成能力,细胞维持在酵母形态;其过量表达会显著促进菌丝的形成,而野生型对照菌株在此条件下仅呈卵圆型的酵母形态。Mhy1对于解脂耶氏酵母的侵入性生长也具有显著的正调控作用,它的缺失及过量表达分别造成侵入性生长的减弱与增强。Mhy1对于解脂耶氏酵母脂肪酶及蛋白酶的分泌具有明显的抑制作用,推测Mhy1参与脂质及蛋白质的代谢调控。此外,Mhy1并不在压力抵抗中起明显作用。它与酿酒酵母和白色念珠菌中Msn2/4家族成员在功能上的差别显示出Mhy1在功能与调控的靶基因方面发生了趋异进化。解脂耶氏酵母YlMsn4尚未被研究报道,我们发现YlMsn4并不参与二型性转换的调控,它的缺失及过量表达并没有造成细胞形态的变化,但是它参与解脂耶氏酵母对酸胁迫的应答,YlMSN4缺失突变体在酸性培养基中生长变慢,细胞变大变圆,显示出与酿酒酵母Msn2/4及白色念珠菌Mnl1同源蛋白功能上的保守性。我们对mhy1?突变体进行MHY1基因回补时,发现MHY1的启动子远长于一般的看家基因启动子,含有1269 bp和1302 bp长度启动子的MHY1基因完全不能够回补mhy1?突变体的菌丝形成缺陷,启动子1338 bp开始出现微弱的回补效果,至2574 bp长度的启动子回补效果依旧微弱,启动子长度达到2895 bp或者3716 bp时回补效果增强,但是仍然不能达到完全回补的水平,直到将启动子延长至3759 bp或者更长时,才能达到与野生型菌株菌丝形成能力一致。该实验结果显示MHY1启动子长度较长,接近4000bp,推测MHY1的转录表达可能受到严格的调控。我们在MHY1启动子中鉴定出一个增强子序列UAS1(-3759 bp至-3449 bp)和一对STRE二联体(-881 bp至-871 bp),这两个元件对于MHY1的表达具有重要作用。UAS1能够显著提高启动子的转录活性,增强回补效果。我们通过EMSA测试发现Mhy1能够结合STRE二联体,调控MHY1自身的表达。鉴于Mhy1对解脂耶氏酵母二型性转换具有重要的调控功能,我们对野生型菌株、mhy1?突变体和过量表达MHY1菌株进行了转录组测序,以揭示Mhy1调控二型性转换机制。转录组测序发现了数量众多的受Mhy1调控的靶基因,以表达水平差距为1倍的显著差异标准进行统计,在mhy1?突变体有456个基因显著下调,126个基因显著上调。过量表达MHY1菌株中有170个基因显著下调,530个基因显著上调,推测Mhy1主要作为正转录调控因子发挥作用。通过对差异基因进行功能聚类,发现Mhy1正调控基因中,细胞壁蛋白及细胞壁形成相关酶类的编码基因出现最明显的富集,推测Mhy1通过调控靶基因中最主要的细胞壁功能相关基因的表达,来调控菌丝的发育。我们通过EMSA测试了一些Mhy1靶基因启动子所含有的STRE元件结合Mhy1的能力,并且对测试的STRE进行突变,检测STRE突变对启动子转录活性的影响,最终鉴定出4个受Mhy1直接调控的靶基因:细胞壁蛋白基因YALI0C23452g、尚未发现明确功能的YALI0C15268和YALI0B09955以及MHY1自身。我们还确定了这些靶基因启动子中的Mhy1结合位点,发现位于STRE元件(AGGGG)5’端的两个碱基,尤其是第二位碱基,对于Mhy1的结合有着重要作用,研究结果显示Mhy1结合靶位点的一致序列为WNAGGGG(W=A或T;N=A、T、C或G)。Mhy1结合位点的发现将会更好地指导人们鉴定受Mhy1直接调控的靶基因,具有重要的价值。


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