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免疫细胞因子IP10-scFv的构建及其抗肿瘤特性研究

郭军庆  
【摘要】:免疫细胞因子(immunocytokine)是一种抗体与细胞因子构成的融合蛋白,它将抗体独特的靶向作用与细胞因子的多功能生物活性有机结合,具有抗体和细胞因子的双重功能,可在肿瘤部位富集高浓度的细胞因子,诱导产生显著抗肿瘤效应,且有效避免细胞因子的毒副作用。 为构建抗肿瘤免疫细胞因子IP10-scFv,首先从RAW 264.7细胞中扩增小鼠趋化因子CXCL10(interferon-γ inducible protein 10,IP-10)基因,并克隆入pGEM-T载体,DNA序列测定表明克隆的CXCL10基因没有碱基突变。 利用重组噬菌体抗体系统(Recombinant Phage Antibody System, RPAS)构建抗酸性同功铁蛋白(acidic isoferritin, AIF)单链抗体(single-chain Fv antibody fragment, scFv)。从分泌抗AIF单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)杂交瘤细胞4c9中分别扩增小鼠抗体重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)基因,用编码(Gly_4Ser)_3柔性接头的linker序列连接V_H和V_L基因(V_H-linker-V_L),并克隆入噬粒pCANTAB 5 E。以重组噬粒pCAN4c9转化大肠杆菌(E. coli)TG1细胞,与辅助噬菌体M13KO7体内重组,构建噬菌体scFv抗体库。用AIF抗原筛选阳性重组噬菌体,并对GP5克隆的scFv基因片段进行序列测定,提交GenBank/EMBL核苷酸数据库(登录号:AY134749).AIF4c9 scFv基因含786个核苷酸(nucleotides, nt),编码261个氨基酸(amino acids, aa),其中V_H 11 8aa、V_L 109aa。AIF4c9 V_H属于V_H Ⅲ基因家族IA亚群,与该亚群中3F1H10 V_H基因的同源性为93%;V_L属V_κ19基因家族V亚群,与101.4.1 V_L基因的同源性达98%,同源性分析提示AIF4c9 scFv的抗原结合位点主要由V_H基因决定。 将AIF4c9 scFv基因亚克隆于原核表达载体pET28a的T7启动子下游,在E. coli BL21(DE3)中高效表达AIF4c9 scFv抗体。SDS-PAGE和Western blotting结果表明,AIF4c9 scFv表达蛋白在细胞质中主要以不溶性包涵体形式存在,不具有抗体活性。为获得功能性scFv抗体,以镍螯合亲和层析为基础建立柱内复性技术,scFv变性蛋白通过其两端的His-tag标签结合于镍螯合层析柱,并在线性降低的尿素浓度梯度复性溶液中逐渐复性,通过加入氧化型和还原型谷胱甘肽(GSSG/GSH)在3 mol/L尿素浓度引入氧化还原环境,显著提高功能性scFv抗体的回收率。优化的柱内复性程序可从高浓度的包涵体变性蛋白(最高15mg/ml)中高效复性AIF4c9 scFv表达蛋白,其回收率可达75%左右。AIF4c9 scFv复性蛋白具有良好的AIF抗体活性,可特异识别AIF抗原,其亲和力常数(K_(DscFv))为7.29×10~(-8)mol/L,约比亲本mAb4c9(K_(DmAb)=4.16×10~(-9)mol/L)低20倍。表达菌体培养物的功能性AIF4c9 scFv抗体产量约为62mg/L。 将小鼠CXCL10和AIF4c9 scFv基因依次亚克隆于真核表达载体pcDNA3的巨细胞病毒启动子(P_(CMV))下游,并以编码(Gly_4Ser)_3柔性接头序列相连接,构建新型免疫细胞因子IP10-scFv,其核苷酸序列在Genbank/EMBL核苷酸数 据库的登录号为AY25 1 299。用线性化表达质粒pc3IPIO4cg转染NSO细胞,经 400林岁ml G418选择培养和ELISA抗体检测,建立稳定表达IP10一scFv融合蛋 白的细胞株。以IP10一scFv表达细胞诱生小鼠腹水,用镍鳌合H始TraP层析柱分 离纯化IPlo一scFv表达蛋白,其分子量约为50 kDa,大于理论估测值(41.1 kDa)。 表达蛋白的糖基化和磷酸化等翻译后修饰直接影响IP 10一scFv融合蛋白表观 分子量。 免疫细胞因子IPIO一scFv既保持了AIF4cg scFv的抗体特异性,又具备小鼠 CXCLIO的趋化活性,具有抗体和趋化因子的双重功能。IPIO一scFv融合蛋白 特异识别AIF,其抗体亲和力常数(KoIP,。一soFv)为2.2sxlo一8 molzL,高于AIF4eg scFv,表明CXCLIO在VHN端的融合不影响scFv抗体对AIF的识别和结合。流 式细胞仪分析显示,IP10一scFv与表达AIF的人肝癌细胞株SMMC 7721及表达 CXCR3受体的活化小鼠T淋巴细胞特异结合。体外趋化试验表明,IP 10一scFv 诱导小鼠T淋巴细胞产生明显趋化,其趋化效应与重组CXCL10相似,而 AIF4cg ScFv未见明显趋化作用,提示IP10一scFv的趋化效应由其CXCL10结构 域诱导产生。结合IP10一scFv的SMMC 7721细胞对小鼠T淋巴细胞也有良好趋 化作用,且强于同等剂量的游离CXCLIO,表明结合于肿瘤细胞的IP10一scFv 融合蛋白具有良好趋化活性,能在肿瘤细胞周围形成趋化因子浓度梯度,有 效募集免疫效应细胞。IPIO一scFv与AIF的结合解离平衡反应促进趋化因子浓 度梯度形成,肿瘤细胞分泌的AIF浓度也与趋化因子浓度梯度密切相关。 为研究免疫细胞因子IP10一scFv的体内抗肿瘤效应,我们选择与IP10一scFv 特异结合的H22小鼠肝癌细胞株建立小鼠肿瘤模型。在H22小鼠肝癌肿瘤模型 中,dl一d12或d6一dlZ肌肉注射2陀/d IPI压scFv融合蛋白显著抑制H22皮下肿瘤 生长,IPIO一scFv试验组肿瘤组织中可见大量淋巴细胞浸润,肿瘤细胞明显减 少,而对照组的肿瘤组织中未见明显淋巴细胞浸润,表明IP10一scFv融合蛋白 特异识别体内H22肿瘤细胞,并在其周围募集免疫效应细胞,诱导产生有效 的抗肿瘤免疫反应。护10一scFv/d6一dlZ试验组的抑瘤效应明显弱于dl一d12,提


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