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水稻抗褐飞虱基因表达调控的分析和抗虫相关cDNA的克隆

王小兰  
【摘要】:水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物,褐飞虱(Nilaparvata lugens St(?)l.)是水稻的主要害虫之一。褐飞虱以口针刺伤水稻茎干,吸取韧皮部的大量汁液作为其营养源,给水稻的生长发育造成危害。随着水稻高密度遗传图谱、物理图谱的建立和全基因组测序的完成,水稻与褐飞虱已成为研究植物对刺吸式昆虫抗性反应分子机理的理想模式系统。深入了解褐飞虱为害水稻和水稻对虫害反应的机理,是有效利用水稻抗性、提高褐飞虱综合防治效果的基础。国内外科学家已经广泛开展了水稻对褐飞虱抗性机理及其生理生化基础的研究,如褐飞虱取食行为和取食生理的研究、不同抗性水稻对褐飞虱生长发育繁殖的影响、以及褐飞虱取食对水稻生长的影响等方面的研究。但是至今对褐飞虱取食造成的水稻伤害分子机理的了解仍然是非常少。B5是药用野生稻(O. officinalis Wall ex Watt)与栽培品种珍汕97B杂交得到的转育材料,带有QbP1和Qbp2两个抗褐飞虱基因,对褐飞虱表现为高抗。本文选用B5为材料,对水稻抗虫反应中基因表达的调控进行了研究,主要结果如下: 1.构建了褐飞虱取食后B5的正、反向抑制差减杂交(Suppression substrative hybridization;SSH)文库。以褐飞虱取食2到52h的B5 cDNA作为Tester,同样褐飞虱处理的10个极感重组自交系(Recombinant inbred lines, RIL)与未被褐飞虱取食的B5 cDNA混合Bulk作为Driver,用来消除背景基因的影响,构建了一个含有3,800克隆的正向SSH文库。反之,以褐飞虱取食的极感群体与未被褐飞虱取食的B5 cDNA混合Bulk作为Tester, 以褐飞虱取食2到犯h的BS cDNA作为Driver,构建了一个含有1,900克 隆的反向SSH文库。 2.筛选得到136个可能的抗虫相关的表达序列标签(ExPressed sequence tags;EsT)。将正向和反向SSH库共5,700克隆提取质粒,以2 XZ的形式 用Q一Pix(Genetix,UK)点于膜上;将褐飞虱取食后的RNA反转录标记成 cDNA为探针,差异筛选抑制差减文库;同样以褐飞虱取食的极感群体与未 被褐飞虱取食的BS混合RNA为Bulk直接标记作为探针差异筛选抑制差减 文库。两种探针间的信号差异达两倍及以上的克隆,作为候选的抗虫相关基 因,一共得到120个上调克隆,34个下调克隆。随机选取28个克隆作进一 步Northem分析,结果证明cDNA~y与Northem杂交得到的结果在变化 趋势上是一致的。对154个克隆进行了测序,经序列同源性比较发现其中有 18个ESTs是重复的;136个单基因中的66个与编码己知功能蛋白的基因高 度同源,其余61个与己经分布的水稻cDNA或基因组序列同源,另有9个 是新的EST。通过分析可知褐飞虱诱导的反应与其它生物、非生物胁迫反应 相互重叠;没有发现JA途径中的基因。同样,在褐飞虱诱导表达的水稻基 因中,有一些是目前为止在其它植物与昆虫关系中没有报道过的,说明水稻 中存在对褐飞虱反应的特异途径。 3.构建了一个褐飞虱诱导的BS cDNA文库。以经褐飞虱取食的三叶期BS 为材料,构建了褐飞虱诱导的全长BS cDNA文库,该文库含有1.1 x 106个 克隆,平均插入片断长度为l.skb,符合筛选低丰度cDNA的要求。 4.分离了三个受褐飞虱诱导的特异表达基因的全长cDNA。选取3个经点 杂交证明受褐飞虱诱导的EST BP巧w001、BP托w042、BP巧w043为探针, 分别筛选BS cDNA文库。其中,基因05一BII的全长共有1,098 bp,开放阅 读框为849bP,编码一285氨基酸的蛋白,分子量为32.6KD。BLAsT查询 发现与顶企DH蛋白有73个氨基酸达37%的同源性,进一步比较发现两个 基因都含有CBS域,同源性主要存在于CBS结构域处。该基因同时也受乙 烯利处理诱导表达上调。基因尺万3全长约goobP,包含408bP的开放阅读 框,编码一136氨基酸的蛋白;基因口s一BiZ属于锌指蛋白家族,全长1.4 了 声 钊 kb,开放阅读框为600 bp。Northern杂交结果证明基因05一刀12,05召论和 尺月呀受褐飞虱诱导表达增强。 5.原位杂交分析。选取了3个经Northem杂交证实受褐飞虱诱导特异表达 的基因进行mRNA原位杂交实验,结果表明,基因os一ncl在未受褐飞虱取 食的水稻根、叶鞘、叶中没有杂交信号。褐飞虱取食后,水稻叶和叶鞘中的 表达急剧增加,除维管束鞘和木质部导管等少数细胞没有表达外,其它包括 叶肉细胞和叶鞘薄壁组织中均有大量表达;而在根中表达较弱,主要零星分 布于皮层薄壁组织和维管薄壁组织中。基因口s一BII在对照中也是不表达, 受褐飞虱取食后,在叶鞘中的表达明显增加。基因尺月呀在对照中有较强的 表达,主要分布在薄壁组织中。在受褐飞虱取食后,叶鞘中的表达主要发生 在维管束鞘周围的薄壁组织中,而离维管组织较远的活细胞其表达呈现下降 趋势,原位杂交结果直观的展现了受褐飞虱诱导的基因在植物组织细胞中的 表达情况,同时也证实这些基因可能参与褐飞虱抗性反应。另外,在基因 尺月了的原位杂交切片中还发现,呈“X”状的强表达信号,说明水稻的短细 胞也可能与褐飞虱的抗性相关。 6.对基因口s一ncl的相关特性分析·。基因05一ncl在Northem杂交中表现为 受褐飞虱强烈诱导,因此,对此基因的相关特性进行了具体分析。以EST BP托wll9 PcR产物为探针,筛


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