汉坦病毒对人胚肺成纤维细胞基因表达及细胞凋亡的影响

【摘要】：汉滩病毒(Hantaan Virus, HTNV)是肾综合征出血热(HFRS)的病原体，属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，它能在原代和传代细胞中增殖，但一般不引起细胞病变效应。研究表明整合素可能充当了汉坦病毒细胞膜受体，与病毒侵入宿主细胞有关，而且汉坦病毒感染会引起宿主细胞形态结构、能量代谢等改变而影响感染细胞的生长，甚至能诱导传代人胚肾细胞和淋巴细胞凋亡，但其作用机制仍不明了。探讨汉坦病毒感染对人胚肺细胞的影响，能为阐明汉坦病毒与宿主细胞相互作用的分子机制提供依据。基因芯片技术的发展为研究病原体与宿主细胞的相互作用开辟了新的领域，表达谱基因芯片通过全面监测病原体感染机体后宿主及病原体基因表达的改变，可回答宿主细胞或器官是如何认识病原体，而且可揭示在何种水平上宿主能对不同因子进行辨别，以及宿主与病原体之间的交谈、潜在的治疗靶位和疾病转归的预后标志。因此，联合应用基因芯片技术、流式细胞术等方法和mRNA合成抑制剂对汉坦病毒感染细胞进行基因及相关蛋白表达水平和细胞周期等进行动态分析，将对研究汉坦病毒与细胞的相互作用添上新的一页。 目的：动态观察汉坦病毒感染原代人胚肺细胞(HEPFs)基因表达谱，进一步分析细胞凋亡关键蛋白的表达变化、细胞膜磷脂酰丝氨酸翻转情况和细胞周期改变，以了解汉坦病毒对HEPFs的作用以及诱导细胞凋亡的情况，为阐明汉坦病毒对宿主细胞的作用机制提供新的理论依据。 方法：1．实验分组及病毒接种 将HEPFs随机分为三组，即病毒感染组，病毒感染及mRNA合成抑制剂3’-脱氧腺苷处理组和对照组。前两组接种HTNV76-118病毒悬液，感染量为5-10 M.O.I．，37℃吸附2小时后接种病毒的细胞和正常对照细胞同时补加5％DMEM维持液继续培养，但病毒感染加3’-脱氧腺苷处理组所加维持液中含有200μM 3’-脱氧腺苷。 2．汉坦病毒感染细胞观察 分别在汉坦病毒感染6、24和96小时及有无3’-脱氧腺苷处理时观察HEPFs，并进行细胞涂片，采用间接免疫荧光法(IFA)对各组细胞进行病毒抗原检测。 3.各组细胞总RNA提取分别在汉坦病毒感染6、24及%小时收集不同时间点 及有无3’一脱氧腺普处理的细胞，改良一步法提取总RNA，并分析RNA质量。 4.病毒核酸检测采用逆转录一聚合酶链反应(RT一PCR)对各组HEPFs总RNA 进行汉坦病毒特异性核酸片段进行检测。 5.基因芯片筛选差异表达基因将各组细胞完整总RNA逆转录并进行荧光标 记，带有Cys荧光标记的实验组和带有cy3荧光标记的对照组探针同时与所用芯片杂 交，然后进行扫描和荧光信号分析筛选出差异表达基因。 6.半肤氨酸蛋白酶(caspase3)蛋白活性检测设立汉坦病毒感染组、汉坦病毒 感染及3’一脱氧腺昔处理组、阴性对照组、汉坦病毒感染加抑制剂组、汉坦病毒感染及 3’一脱氧腺普处理加casPase3抑制剂组、汉坦病毒感染不加casPase3底物组和汉坦病 毒感染及3’一脱氧腺普处理不加底物组，并且每组细胞样本设立二重复。分别在不同时 间点收集各组细胞，经裂解液裂解细胞后，收集各样本上清液，根据Caspase3检测试 剂盒说明进行后续操作，经光谱分析测定仪读取数据，并建立标准曲线计算出caspase3 的活性单位。 7.细胞膜磷脂酞丝氨酸(PS)翻转测定分别在不同时间点收集各组细胞，设立二 重复。按照APoAlert钙依赖磷脂结合蛋白v(AnnexinV)试剂盒操作步骤通过流式 细胞分析仪对各样本细胞膜上PS的情况进行分析，并用WlnMID 2 .8软件对数据进行 整理和分析。 8.细胞周期分析分别在不同时间点收集各组细胞，设立二重复。细胞经乙醇固 定后，用碘化丙锭(Pl)溶液(Pl 509/ml，0.1%柠檬酸钠，0.2%Np一40，RNA酶0.25 mg/ml)避光染色后通过流式细胞分析仪对细胞周期进行分析。根据细胞周期分析程 序(B eekinen Coulter)计算GO/GI，GZ舰，S和sub一GI各期的细胞数目。 结果:1.病毒感染细胞形态及病毒抗原表达在汉坦病毒感染6、24和%小时 不同时间点及有无3’一脱氧腺昔处理细胞时，显微镜下观察各组细胞的形态没有明显差 异，病毒抗原也没有检测到。 2.细胞样本总RNA质量紫外分光光度法分析表明汉坦病毒感染组、汉坦病毒 感染并给予3’一脱氧腺昔处理组和对照组总RNA OD26夕O场8。比值均在2，0左右，这和 电泳结果共同表明RNA质量较高，符合实验要求。 3.病毒核酸检测汉坦病毒感染人胚肺细胞6、24和%小时以及给予3’一脱氧腺 昔处理时，都能检测到特异性汉坦病毒核酸片段。 4.基因差异表达汉坦病毒76一118株感染HEPFs6小时时，有134项基因出现差 异表达，给予RNA合成抑制剂3’一脱氧腺普处理时有“项基因出现差异表达;在感染 后24小时有27项基因出现差异表达，给予3’一脱氧腺昔处理时，有195项基因出现差 异表达;当感染%小时，有7项基因出现差异表达，给予3’一脱氧腺昔处理时，有130 项基因出现差异表达。分析不同时间点、不同处理细胞差异表达基因及其Ratio值显 示表达上调的基因共有292项:其中感染6小时有97项，感染并给予3’一脱氧腺昔有 25项;感染24小时有10项，感染并给予3’一脱氧腺昔有109项;感染96小时有3项， 感染并给予3’一