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猪—人异种移植相关实验研究——中国猪种SLA基因序列分析及人NK细胞通过胞吐途径杀伤猪内皮细胞的机制探讨

吴群  
【摘要】:同种异体移植已在临床广泛开展,并成为根治许多终末期器官功能衰竭疾病的唯一手段。目前面临的问题是:人器官移植物来源十分有限,且获得供体的时机极为随机,以至临床需求缺口日益扩大,并成为制约临床开展移植术的主要因素。为解决供体器官严重短缺的难题,应用异种动物(主要是猪)为供体的异种移植成为近年移植免疫学领域的研究热点之一。 由于灵长类动物(包括人)体内存在针对猪组织细胞表面α-半乳糖苷的天然抗体,故猪→人异种移植中,人天然抗体可与猪组织细胞表面抗原结合,通过激活补体而导致供者移植物细胞溶解,并引发超急性排斥反应。国内外均已报道:通过抑制受者补体系统激活等手段,可成功克服超急性异种移植排斥反应。因此,异种移植后的急性血管性排斥反应和急性细胞性排斥反应成为人们关注的重点。目前有关异种移植的实验研究主要集中于如下领域:①猪的主要组织相容性复合体(SLA);②NK细胞ADCC效应对异种靶细胞的杀伤作用,以及人CD4~+和CD8~+T细胞介导异种细胞移植排斥反应的机制。 本课题分析中国猪种SLA基因结构特征,以及人NK细胞杀伤异种靶细胞过程中的胞吐作用及其机制,其立题依据是: 1.猪MHC(SLA)分子是引发急性和慢性异种移植排斥反应的关键抗原,分析比较SLA与人HLA复合体遗传结构的异同,有助于探讨异种移植排斥反应的发生机制,并为选择猪种和制定临床干预方案提供重要线索。 2.人NK细胞是参与异种移植排斥反应的重要效应细胞,其被靶细胞(即猪血管内皮细胞)触发,通过杀伤性胞吐(脱颗粒)过程而释放颗粒酶、穿孔素等,可对猪血管内皮细胞发挥杀伤效应,此乃猪→人异种器官移植急性排斥反应中最早发生和最关键的病理过程。 一、异种移植备选中国猪种的经典SLA基因序列分析 近二十余年,国外已分析了多个实验猪种的SLA复合体及其抗原系统,为探讨人类免疫系统识别SLA抗原的机制奠定了理论基础。 我国是猪种资源最为丰富的国家,猪种遗传性状稳定,为筛选合适的供体猪种提供了有利条件。为探讨我国猪种SLA基因结构及其在猪→人异种器官移植中的作用,本 课题选择中国不同地区3个常见实验用猪种—湖北中华大白猪封闭群、海南五指山猪 近交系和云南版纳小耳猪近交系为研究对象,根据Genbank中NIH小型猪SLAI类和 n类基因序列设计引物,采用RT一PCR方法获得相应基因的cDNA产物,电泳鉴定后纯 化,对PCR产物进行直接测序或克隆入测序T载体后进行双向测序,获得中国猪种SLA I类和n类基因cDNA序列,进而借助DNA Tools 5.0软件包和GCG Ver. 2.9软件包进 行相关比较和分析。本课题的实验结果为: 1 .3个中国猪种SLA一DRA基因为高度保守序列,无多态性,与NIH小型猪在核 昔酸和氨基酸水平的同源性均为100%;3个中国猪种其他的经典SLAI类和n类基因 (PI、P14、DQA、DQB、D邓)均具多态性,与NIH小型猪在核昔酸水平同源性高 于90%,在氨基酸水平同源性高于87%。结果提示:受试中国猪种Pl、P14、DQA、 DQB、DRB基因分别为相应基因座位上的新等位基因。 2.中国人群中HLAI类高频等位基因HLA一A*0 201与中国猪种P1和P14基因产 物的氨基酸序列同源性仅为63%,但在MHC分子多态样al和a2功能区中与抗原肤锚 着位相对应的位点,其氨基酸残基基本相同。结果提示:不同种属动物MHC分子肤结 合区的差异较小,具有一定保守性。 3 .SLA一Pl、SLA一P14和HLA一A*0201产物中参与同人CDS结合所必需的关键氨 基酸残基,仅有两个存在差异,即:第223位丙氨酸(Ala)变为缴氨酸(Val);第 235位丙氨酸(Ala)变为赖氨酸(Lys)。SLA一Pl、SLA一P14和HLA一A*0201产物中参 与同人CDS结合所必需的关键氨基酸残基的高度相似性,提示SLAI类分子可跨越种 属界限而与人CDS分子结合,从而发挥相应生物学作用。 4.两个近交系猪种SLA一DRA和人HLA一DRA产物与CD4分子结合所必需的关键 氨基酸残基基本相同,仅在两个位点发生相同变异,即:第125位精氨酸(Arg)变为 甘氨酸(Gly);第129位撷氨酸(Val)变为异亮氨酸(I le)。而SLA一DRB分子参与 结合CD4所必需的关键氨基酸残基与人类完全相同,此现象在国内外其他猪种SLA序 列研究中尚未见报道。上述结果,即SLAn类分子和人HLAn类分子结构具有高度相 似性,进一步提示:中国猪种SLAH类分子可跨越种属界限而与人CD4分子结合,并 发挥相应生物学作用。 5.中国猪种SLAI类分子(P1和P14)缺乏与NK细胞表面杀伤细胞抑制性受体 (KIR)结合的关键氨基酸残基。提示:由于缺乏KIR的配基序列,中国猪种组织细胞 难以启动NK细胞的负调节信号,故猪源移植物易遭人(受者)NK细胞杀伤。由此, 本课题从新的角度阐明了猪~人异种移植中猪源组织细胞受损的可能机制。 综上所述,通过在分子遗传学水平分析、比较SLA和HLA基因结构,发现海南五 指山猪近交系和云南版纳小耳猪近交系SLA与人HLA遗传背景具有高度相似性,但两 个中国猪种相关基因序列发生变异的氨基酸残基与NIH小型猪有所不同。本课题获得 了中国主要实验猪种SLA基因结构的初步信息,通过进一步阐明所发生变异的确切生 物学作用,可望为中国猪种用于人类


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