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植物逆境相关基因的克隆、表达及功能分析

余涛  
【摘要】:自然界中的植物经常遭受各种各样的逆境胁迫伤害,每年由于自然灾害的原因造成大量作物减产,并严重影响各种农产品的品质。研究植物在不良环境下生命活动的规律,弄清其抗逆性的细胞及生理学基础并加以调控,不仅有助于全面和彻底地了解植物正常生理活动,而且对提高农业生产力、保护环境也有重要的指导作用,因此,它一直是植物学研究中的重要内容之一。 为了探讨植物抗逆反应机理,本文使用差异显示技术分别从单子叶植物水稻和双子叶植物烟草中克隆受逆境调控表达的基因,分析了它们在多种逆境处理下的表达模式,并使用转基因烟草研究了谷胱甘肽S转移酶在植物抗氧化胁迫中的作用,具体内容如下: 1、用改进的差异显示技术从烟草中分离受乙烯利调控表达的基因,共获得24条在对照和乙烯利处理烟草叶片中表达有差异的cDNA片段。这些差异片段经点杂交验证后表明,17条为真实的阳性片段,其中12条表达受乙烯利诱导,另外5条表达受乙烯利抑制。测序后使用GenBank搜索软件对这些差异片段进行了序列分析,结果显示,这12条受乙烯利诱导表达增强的基因主要为逆境及PCD相关基因、植物激素相关基因以及一些细胞壁相关蛋白基因。其中有5条为尚未克隆的新基因,使用RACE扩增获得其中一条基因的全长cDNA 序列。另外5条受乙烯利抑制表达的基因片段经序列分析后证实均为与植物光合作用相关的蛋白基因,这说明乙烯与植物的光合作用密切相关。为了研究这些乙烯利诱导基因与植物逆境的关系,我们采用RT-PCR的方法分析了它们在各种不同逆境下的表达模式,从而探讨了它们在植物抵抗逆境反应中可能的功能。 2、采用改进的差异显示技术从单子叶植物水稻中分离受氧化胁迫调控表达的基因,获得4条真实的差异表达片段,其中2条受氧化胁迫诱导表达增强,序列分析表明为未知功能的新基因,分别编码植物中一个可能的谷胱甘肽转运蛋白和一个推测的C末端结合蛋白。另2条受氧化胁迫抑制表达,序列分析表明它们与水稻中的两个已知基因高度同源。为了探讨它们在植物抗逆反应中的功能,我们使用Northern杂交分析了这4个基因受不同逆境及逆境信号分子(SA、ABA、乙烯)处理后的表达模式,研究了它们与植物逆境的关系。 3、用农杆菌介导的叶盘转化法将一个来自棉花的谷胱甘肽S转移 酶(GST)基因转化到烟草中。转基因烟草使用Sotltllen:杂交验证表 明,外源的GST基因己经整合到烟草的基因组中,同时还表明,在烟 草荃因组中也存在多个内源的GST基因拷贝,证实GS厂fs是一个大从 因家族。使用酶活测定和Nortllem分析鉴定了3株过表达外源(}S‘f自勺 转墓因烟草,并检测了它们对氧化剂甲基紫晶(MV)诱导的氧化胁迫 的抵抗能力。日一十盘离子渗漏分析表明,与对照相比,过表达外源GST 基因的转基因烟草具有较强的抗氧化胁迫的能力。此外,使用酶活测 定的方法检测了MV处理过程中,对照和转基因烟草中6种抗轨化酶 (GS1’,谷肤卜「肤过氧化物酶,抗坏血酸过氧化物酶,过轨化城酶,超 氧化物岐化醉,过氧化物酶)活力的变化,比较了氧化J])].迫卜这两种 材右}中的抗氧化酶活力的变化。


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