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Ca~(2+)诱导大肠杆菌摄取外源DNA的研究

李文化  
【摘要】:本文通过测定大肠杆菌感受态细胞中Ca~(2+)的含量和分布,并分别以AMP及非选择性DNA分子、La~(3+)和量子点为探针,研究Ca~(2+)诱导大肠杆菌建立感受态并介导摄取外源DNA的分子机理,得到以下研究结果: 1.实验发现在二价金属离子ca~(2+)、Mn~(2+)、Mg~(2+)中,Ca~(2+)诱导大肠杆菌建立感受态并实现质粒DNA转化的作用效率最高:Ca~(2+)2可促进大肠杆菌的生长,但生长在含较高浓度(50,100mmol/L)Ca~(2+)培养基中的大肠杆菌,其摄取外源DNA的能力并未发生改变;大肠杆菌实现摄取外源DNA的必备条件是大肠杆菌细胞、适当浓度的Ca~(2+)和转化DNA同时共处于同一体系;Ca~(2+)诱导大肠杆菌摄取外源DNA的作用发生在转化过程中,与转化前的处理无关;转化步骤中的DNA与受体细胞冰浴静置、热激和温育等过程也不是DNA进入受体细胞的必需条件,但这些操作可或多或少地提高DNA的转化效率。 2.建立了用Fura-2/AM作探针测定大肠杆菌感受态细胞内Ca~(2+)变化的灵敏方法,也将细胞内Ca~(2+)定位的焦亚锑酸钾法借鉴到研究大肠杆菌感受态细胞中Ca~(2+)的分布情况。结果表明,用100mmol/LCaCl_2处理大肠杆菌细胞,有少量Ca~(2+)可以进入到细胞内,并且这种进入在瞬间内(<1s)就能完成,而大量Ca~(2+)聚集在细胞表面或细胞周质。 3.大肠杆菌在低Ca~(2+)条件下(5~20 mmol/L)可以摄取外源DNA,但其效率要比 在高C扩十条件下低得多。并且实验发现通过这种方式摄取的质粒DNA与传统转化 方法导入的质粒DNA具有相同的生物学效应,即进入细胞内的DNA能正常的复制、 表达并表现出遗传效应。 4.AMP可轻微刺激大肠杆菌的生长,但对细胞内质粒和染色体上相关基因的表达 无影响;单磷酸嗓吟碱基(AMP和GN田)都能抑制大肠杆菌摄取外源DNA,并且 这种抑制作用发生在感受态形成过程,AMP抑制作用具有浓度效应和时间效应, 作用浓度越高处理时间越长,抑制效果越明显;非选择性DNA分子,无论其大小、 结构和G+C含量的高低,都对大肠杆菌感受态的形成和目的DNA的转化无明显影 响。 5.适当浓度的L扩十可促进大肠杆菌细胞的代谢活动,不影响细胞内质粒和染色体 上相关基因的表达,但可使细胞的电子显微镜表像发生改变。尽管L扩+在诸多化学 性质上同c扩十类似,但L扩十不能诱导大肠杆菌形成感受态和摄取外源DNA,并且 在低浓度条件下(0一10阔mL)就能显著降低DNA的转化效率,在高浓度下 (30林留mL)完全抑制大肠杆菌摄取DNA的能力。这种抑制作用可能发生在DNA 的转化过程中,只要转化体系中含有一定的L扩+,就能引起大肠杆菌质粒DNA转 化效率的显著降低或使其完全丧失摄取DNA的能力。 6.用量子点标记大肠杆菌感受态细胞并用原子力显微镜观察发现,IO0nuno比CaC12 诱导处理后的大肠杆菌细胞表面发生了显著变化,细胞表面变得不平整,较非感受 态细胞起伏大,并且细胞壁出现损伤,形成直径大小约50一300nm的小孔,直径大 小约3一4nm的量子点能够进入大肠杆菌感受态细胞但不能进入非感受态细胞。 综合以上实验结果我们认为,大肠杆菌细胞表面没有结合DNA的特异性受体 存在,金属离子诱导大肠杆菌摄取外源DNA具有一定的特异性。高浓度非生理条 件下c扩+诱导大肠杆菌摄取外源DNA,可能一方面是高浓度的C扩斗聚集在细胞表 面改变了细胞壁的渗透性,使转化DNA更容易接近细胞膜。另一方面少量C扩十进 入细胞与胞内的PHB和Pi结合成复合物,在细胞膜上形成新的膜通道,为DNA 最终进入细胞内提供了条件。低c扩+诱导大肠杆菌摄取DNA可能主要是后者的作 用。因此,c扩十诱导大肠杆菌建立感受态并实现DNA转化,既是一个物理化学过 程,也是细胞自身生理调节的反应过程。这些研究结果对于我们探索大肠杆菌摄取 外源DNA的分子机理,提高基因工程操作中将重组DNA导入受体细胞的效率,以 及正确评估大肠杆菌可能发生的水平基因转移事件具有重要意义。


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