白蛋白诱导的肾小管细胞凋亡与MAPK信号通路

【摘要】：各种以持续性蛋白质为主要表现的肾脏疾病最后的病理变化均表现为肾小球硬化和肾小管间质纤维化，但近年来的研究表明肾小管间质病变与肾功能损害和疾病预后有着更为密切的联系。已经证实蛋白尿水平与慢性肾衰进展的速度密切相关。大量的临床研究和动物实验发现尿蛋白可直接导致肾小管间质受损，然而其机制仍未完全明了，对蛋白尿导致小管间质损害也无有效的治疗手段。因此，本研究拟探讨以下问题：1．白蛋白是否诱导肾小管上皮细胞凋亡以及诱导凋亡的信号传导机制；2．牛磺酸是否对白蛋白诱导的肾小管上皮细胞凋亡有保护作用；3．大量持续性蛋白尿病人是否发生肾小管上皮细胞凋亡。 为了探讨尿蛋白对肾小管细胞的损伤作用机制，在本研究的第一部分，我们将培养的大鼠肾小管细胞NRK-52E分别与不同浓度(10，20，30mg／ml)的去脂无内毒素牛血清白蛋白(BSA)共同孵育6，12，18和24小时。进行台盼蓝排除试验，确定坏死细胞少于10％，不会干扰后续实验。然后用倒置显微镜、透射电镜、扫描电镜、共聚焦激光显微系统和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果显示白蛋白以时间和剂量依赖方式导致肾小管细胞凋亡。 细胞凋亡是受基因调控的程序性细胞死亡。一系列信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路参与细胞内外信号转导。p38和JNK由促炎细胞因子、热休克、高渗状态和其它应激因素激活，参与细胞凋亡过程。ERK则被丝裂原和生长因子激活，主要参与细胞增生和分化。因此我们推测MAPKs可能介导了白蛋白诱导的肾小管细胞凋亡。为此我们应用BSA30mg／ml刺激NRK-52E细胞15、30、60和120分钟后，采用Westen blot测定p38、JNK和ERK活性；为观察p38、JNK和ERK对白蛋白诱导肾小管细胞凋亡的影响，将SB202190(20μM，p38抑制剂)、SP600125(10μM，JNK抑制剂)和PD098059(20μM，ERK抑制剂)分别与白蛋白和NRK-52E细胞共同孵育24小时后检测细胞凋亡。结果显示：白蛋白与NRK-52E细胞共孵育后，p38和JNK活性明显升高，ERK活性显著降低；SB202190和SP600125可分别抑制白蛋白诱导NRK-52E细胞凋亡，而PD098059 促进白蛋白诱导的NRK一52E细胞凋亡。 由于白蛋白诱导肾小管细胞凋亡是蛋白尿导致肾小管间质损害的重要因素之 一，因此，寻找干预肾小管细胞凋亡的治疗方法显得非常必要。牛磺酸是一种含 硫氨基酸，它在多种基本的生物学过程中(如中枢神经系统和视网膜的发育、钙 调节、膜稳定、生殖和免疫功能)起重要作用。最近有研究提示牛磺酸具有细胞保 护作用，可减轻缺血时细胞凋亡的程度。因此我们观察牛磺酸能否影响白蛋白诱 导肾小管细胞凋亡。将不同浓度(10、20、30和40 mM)的牛磺酸和BSA(3omg/ml) 与NRK一52E细胞共孵育后检测细胞凋亡及p38、JNK、ERK活性。我们发现经牛 磺酸处理后，白蛋白诱导NRK一52E细胞凋亡明显减少;p38和州K活性明显降低， ERK活性明显增高。 为了进一步探讨蛋白尿与肾小管间质细胞凋亡的关系，我们评价了原发性肾 病综合征大量蛋白尿患者的肾活检标本，进行苏木精伊红(HE)染色，置光镜下 观察可见肾小管上皮细胞凋亡。 综上所述，本文通过白蛋白刺激肾小管细胞的体外实验和评价原发性肾病综 合征病人的肾活检标本，发现白蛋白以时间和剂量依赖方式诱导肾小管细胞凋亡; P38和州K激活与ERK抑制介导了白蛋白诱导的肾小管细胞凋亡;牛磺酸通过抑 制p38、JNK并激活ERK而对抗白蛋白诱导的肾小管细胞凋亡;大量持续性蛋白 尿患者存在肾小管上皮细胞凋亡。