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靶向防龋DNA疫苗增强免疫效果与机制研究

贾荣  
【摘要】:龋病目前仍旧是在人类中发病率最高的一种疾病。变形链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)是人类最主要的致龋菌。其最主要的致龋毒力因子主要包括表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶(glucosyltransferase GTF),前者介导变形链球菌在牙面的蔗糖非依赖性粘附,后者参与介导了细菌与牙面获得性膜的蔗糖依赖性的粘附过程。研究表明针对这两种毒力因子的抗体可有效地抑制其功能。 防龋疫苗的研究经历了全菌疫苗、多肽疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗等过程,上世纪90年代初发展起来的DNA疫苗是一种新型的疫苗,具有能够同时诱导体液和细胞免疫,免疫应答持久,研制相对简单,保存运输方便等优点,给免疫防龋提供了新的思路。近年来国内防龋DNA疫苗的研究也得到了发展,本室构建的抗PAc蛋白A区、P区的防龋DNA疫苗pCIA-P可以有效激发唾液特异性分泌型IgA(secretory IgA,S-IgA)抗体的产生,具有防龋效果。本室又研制了针对PAc A区、P区与GTF-Ⅰ GLU片段的融合防龋DNA疫苗pGLUA-P,体外细胞表达证实了可以表达融合抗原。然而目前研制的DNA疫苗大都面临在大动物或人体上免疫原性差的问题,因此研究热点转移到如何提高DNA疫苗的免疫效能,防龋DNA疫苗也同样面临如何进一步提高免疫效果的问题。 1998年澳大利亚学者Boyle等研制了结合有细胞毒淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA4)胞外区基因片段的靶向DNA疫苗并免疫小鼠,2周后测得特异性抗体水平比非靶向对照组高达10000倍。其机制可能为CTLA4能够引导抗原与重要的抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)—树突状细胞(dendritic cells,DC)表面的配体B7分子结合,促进抗原被DC摄取、加工和提呈给免疫系统,从而增强了免疫效果。值得注意的是,在靶向DNA疫苗中增加抗原片段明显降低了靶向DNA疫苗增强免疫效果的能力。因此CTLA4靶向疫苗增强DNA疫苗免疫效果的机制有待进一步研究。 本研究将pGLUA-P免疫定菌大鼠,探讨其诱导免疫反应抑制龋病的能力;构建编码CTLA4的信号肽和胞外区基因与免疫球蛋白IgG1型的铰链区和CH2、CH3区基因片段的靶向防龋DNA疫苗,并经系统和粘膜途径免疫猴、兔等动物,探索其免疫效果;构建了携带不同长度抗原片段的靶向防龋DNA疫苗免疫小鼠,构建稳定表达人B7分子的CHO细胞株和绿色荧光蛋白标记的靶向真核表达质粒,探索靶向DNA疫苗增强免疫效果的机制。 本实验分五部分: 第一部分 融合防龋DNA疫苗 的体外表达和免疫动物实验研究 将融合防龋DNA疫苗PGLUA一P体外以阳离子脂质体Dosper(1,3一Di一olcoyloxy一2- (6一Carboxy‘spennyl)·propyl一amid)转染CHo细胞(C址nese Hamaster ov脚cell),采用免 疫细胞荧光检测技术,以抗P八£和抗GTF抗体检测重组蛋白在细胞中的表达。结果:经 pGLUA.p转染CHo细胞,用抗PAc和抗GTF抗体检测,镜下呈强烈的特异性红色荧 光,证实了PGLUA-P也能在CHO稳定传代细胞系中表达重组蛋白,且重组蛋白同时具 有PAc和GTF免疫反应性。 将闪LUA一P或携带pac基因A一P基因片段的DNA防龋疫苗pC认一以领下腺周围 区域皮下注射(TsG)或股四头肌注射途径分别免疫定菌SD大鼠,以EUSA法检测血 清和唾液中的抗体水平,采用Keyes法评估大鼠磨牙患龋情况。结果:pGLUA,p和PCIA-P 经TSG免疫及股四头肌注射免疫组的血清抗PAc的IgG抗体水平明显高于对照组 伊动 .01),声切A,p和解认,P经TSG免疫组的唾液抗P八‘的IgA抗体水平明显高于其 余组俨‘.仍);声LUA-p经TSG免疫组的釉质龋和牙本质浅龋记分最低伊动.05);经 双好免疫丙LUA矛组和解飞‘P组的牙本质中龋记分最低(挤习.01)。Gr F.p冉‘融合防龋 DNA疫苗丙U山‘P可以有效地诱导机体的免疫反应,抑制龋病的发生和发展,防龋效 果优于防龋DNA疫苗沐1午P。 采用PCR技术获得变形链球菌葡糖基转移酶GTF~1的全长基因并克隆到原核表达载 体PQE30中,在大肠杆菌JM109中以IpTG诱导表达重组葡糖基转移酶GTF一,以金属 鳌合亲和层析法提取和纯化了重组葡糖基转移酶GTF一I。结果:重组蛋白分子量正确, 具有G吓一I的免疫反应性,为融合防龋DNA疫苗和靶向防龋DNA疫苗的研制提供必要 的物质基础。 第二部分靶向防龋DNA疫苗的构建和鉴定 利用RT.PCR的方法从外周淋巴细胞中获得CTLA4胞外区和Ig丫1恒定区基因并克 隆入融合防龋DNA疫苗pGLUA一P中,构建出靶向融合防龋DNA疫苗pGJA.p,并转染 CHO细胞系,蛋白质免疫印迹实验检测其表达。选用成年雌性日本大耳白兔分组,分别 用pGJA.p和pGLUA.p经肌肉注射及鼻粘膜免疫,一个月后各组以同样的剂量加强免 疫一次。免疫前后收集血清及唾液样本,酶联免疫吸附实验检测特异性抗体。用收集的 血清进行葡糖基转移酶(GTF)合成水不溶性葡聚糖抑制实验。结果:重组质粒POJA.p 含有CTU拼、lg丫1、A.p和GLU基因序列。蛋白质免疫印迹结果显示pG工A.p表达的 抗原可以与特异性抗PAc或抗GTF抗体发生免疫反应。抗体检测结果显示pGJA.p肌肉 注射组诱导的血清IgG抗体水平远高于pGLuA一P肌肉注射组(P0 .01);pGJA一P鼻粘膜 免疫组诱导的唾液IgA抗体水平


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