收藏本站
收藏 | 论文排版

变形链球菌耐酸性相关基因的研究

卫华  
【摘要】:变形链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)在龋病的发生和发展中起重要作用,其致龋性除与对牙面的粘附作用有关外,还与产酸性和耐酸性密切相关。关于变形链球菌粘附性和产酸性的分子机制已很清晰,而对于其耐酸性的机制尤其是分子机制的研究才刚刚起步,也是近年来的研究热点之一。 研究表明变形链球菌的耐酸性包括两方面的内容:固有耐酸性(constitutive acid tolerance)和耐酸反应性(acid adaptation or acid tolerance response,ATR),两者均与质子移位膜ATP酶(H~+-ATPase)的活性和最适pH值有关,H~+-ATPase的活性越大、最适pH值越低,则其在酸性环境中排除多余H~+的能力越强,因而越耐酸。随着现代分子生物学的发展,对变形链球菌包括耐酸性在内的应激反应的研究越来越深入,越来越多的与耐酸性相关的基因也陆续被发现。其中最行之有效的方法是转座因子诱变技术,即利用转座因子能够在基因组中随机移动位置的特性,诱导转座因子插入到基因组的不同位置,产生在不同位点突变的突变株库,用合适的筛选方法筛选出某种表型发生突变的突变株,如果该突变株表型的改变是由于转座因子的单一插入引起的基因水平的变异,则转座因子插入位点必然与该表型有关。运用各种分子生物学手段发现转座因子的插入位点及其侧翼基因,进而分析该位点所在基因或其侧翼基因对该表型的调控机制。研究表明对变形链球菌的转座因子诱变使用转座因子Tn917最方便且有效。 变形链球菌UA159是目前为止唯一一株已知基因组全序列的变形链球菌,它的测序成功为研究变形链球菌基因提供了捷径。对于已知表型而未知其调控基因的变形链球菌的分子遗传学研究,选用变形链球菌UA159作为实验菌株的优点在于,只要发现了与该表型相关的位点附近的一小段基因,即可到Genbank中查找其上下游的基因,进而分析 其调控机制。 本研究首次采用转座因子Tn917随机诱变变形链球菌UA巧9,成功地筛选出了一株 对酸敏感的变形链球菌耐酸性缺陷突变株b23,Southem杂交和遗传回交试验证实b23 表型的改变(即耐酸性的降低)是由于转座因子Tn917的单一插入所引起的基因水平的 变异所致。对比变形链球菌UA159野生株及耐酸性缺陷株b23蔗糖依赖性粘附,二者无 差别,故b23不适宜做龋病替代治疗的效应菌株;对比二者在不同pH值时的生长、糖 酵解耐酸性、H十一‘即ase活性和致死性pH值,证实变形链球菌b23在耐酸性的各个层面 均比UA159差。最后,用不对称PCR法获得转座因子Tn917插入位点5’侧的基因片 段,经BLAST分析找出其在变形链球菌UA159基因组中的位置,再根据已知的插入位 点下游的基因组序列和Tn9l73’端序列设计引物,PCR扩增出插入位点下游的序列,分 析其上下游基因,试图寻找一个新的与变形链球菌耐酸性相关的基因并探讨其可能的调 控机制。 本研究分以下三部分进行: 第一部分变形链球菌耐酸性缺陷株的构建 首先,碱裂解法和聚乙二醇沉淀法提取含转座因子Th917的温度敏感型质粒 pTvl一oK,用于转化变形链球菌野生株UA159。由于变形链球菌是转化率很低的革兰氏 阳性菌,所以本实验用感受态激发肤(CSP)诱导变形链球菌UA159进入易于摄取外源 性DNA的状态,将转化率提高了20倍以上。其次,诱导转座因子Th917发生转座。将 含质粒pTvl一OK的转化株在含抗生素的培养基中28℃生长饱和后,按不同比例稀释至 新鲜培养基中并置于非允许温度(37一42℃)下培养过夜,摸索出最佳的诱导Th917发生 转座的条件为1:100或1:200稀释至新鲜的不含抗生素或含0.04p创inl红霉素的培养基 中,42℃培养过夜。第三,从大量的发生转座的转座株库中筛选在pHS.O的固体培养基 上不能生长的突变株,即为耐酸性缺陷株。从2316个转座株中成功地筛选出一株对酸敏 感的耐酸性缺陷株,命名为变形链球菌b23。第四,以含部分Th917的片段的DIG标记 探针和EcoRI消化的变形链球菌UA巧9和b23基因组进行Southem杂交,结果证实耐 酸性缺陷株b23的基因组中有且只有单一的Th917的插入。将耐酸性缺陷株b23的基因 II 组DNA转化入另一株变形链球菌野生株MT8148中(遗传回交实验),转化后的细菌耐 酸性较野生株降低。Southern杂交和遗传回交实验的结果证实了耐酸性缺陷株b23表型 的改变(即耐酸性的降低)是由Tn917的单一插入所引起的基因水平的变异所致。 第二部分变形链球菌耐酸性缺陷株生化特征的研究 对比变形链球菌野生株UA巧9和耐酸性缺陷株b23的粘附性,探讨b23是否适合作 为龋病替代治疗的效应菌株。对比二者在不同 pH值的固体培养基的生长情况及在不同 pH值的液体培养基中的生长曲线;对比二者的糖酵解降低曲线及糖酵解最低pH值;对 比二者的戌I下ase活性;对比二者的致死性pH值。结果表明,b23的粘附性与UA159 相比并没有显著增强,故不适宜用于龋病的替代治疗;在pH7.o的固体培养基上,b23 生长良好,与野生株无差异,在低pH值培养基上,b23生长均差于UA159,在pHS.0 时b23不能生长,而UA159尚有部分生长;在含过量糖的培养基中,UA159在pH7.5 和pHS.


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 彭圆媛;刘梅玲;马飞;林小洁;陶人川;;儿童唾液变形链球菌与患龋状况关系的研究[J];临床口腔医学杂志;2011年07期
2 王成龙;邓斌;李华;苏东华;;美兰和超氧化物歧化酶对变形链球菌产酸作用的影响[J];临床口腔医学杂志;2011年08期
3 李文卿;林家成;卢佳璇;赵玮;;重症婴幼儿龋及无龋儿童牙菌斑中变形链球菌的致龋性比较[J];中华口腔医学研究杂志(电子版);2011年04期
4 ;中文文摘[J];口腔生物医学;2011年02期
5 凌均棨;杨芳;滕飞;;新一代高通量技术在龋病相关的口腔菌群宏基因组学研究中的应用[J];中华口腔医学研究杂志(电子版);2011年04期
6 孟萍萍;郭晶;王立强;;中药黄连防治龋齿的研究[J];中国医药科学;2011年15期
7 高静;;十种洁齿食物[J];农产品市场周刊;2011年23期
8 刘翠娟;郭红;李长义;;甲基丙烯酸树脂表面粗糙度与细菌黏附和色素沉着关系的研究[J];口腔颌面修复学杂志;2011年03期
9 齐芳芳;王山;郭洁;李颖辉;崔占琴;赵满琳;;茶多酚、厚朴酚抑制早期人工根面龋作用的实验研究[J];现代口腔医学杂志;2011年05期
10 郑斌;许兵红;;蜂胶抗病原生物作用的研究进展[J];中国病原生物学杂志;2011年07期
11 马庆东;李国玉;王金辉;;维吾尔药阿育魏实药理活性研究进展[J];农垦医学;2011年02期
12 刘扬;于静涛;孙莹莹;宋雪莲;;壳聚糖及其衍生物抗菌性能研究进展[J];中国实用口腔科杂志;2011年07期
13 许少鹏;;纳米羟基磷灰石在口腔护理产品中的应用[J];中国洗涤用品工业;2011年04期
14 徐皑;李艳萍;刘兴容;;酪蛋白磷酸肽钙磷复合体对黏性放线菌黏附影响的实验研究[J];泸州医学院学报;2011年05期
15 ;[J];;年期
16 ;[J];;年期
17 ;[J];;年期
18 ;[J];;年期
19 ;[J];;年期
20 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张蕾;邹朝晖;陈阵;马莹莹;李敏;;不同能量密度HMME-PDT对致龋模型变形链球菌的杀伤效果及安全性研究[A];全国第八次牙体牙髓病学学术会议论文汇编[C];2011年
2 赵今;林静;努尔比亚木·麦麦提依明;李亮;连冰洁;;新疆乌鲁木齐市维吾尔族和汉族重度龋儿童口腔变形链球菌基因多态性分析[A];全国第八次牙体牙髓病学学术会议论文汇编[C];2011年
3 徐树军;吴补领;闫文娟;高杰;邵龙泉;;c-di-GMP对变形链球菌基因表达谱影响的研究[A];全国第八次牙体牙髓病学学术会议论文汇编[C];2011年
4 马宏;李玉晶;;氟钼酸铵对变形链球菌生长、产酸和胞外葡聚糖合成的影响[A];全国第四次牙体牙髓病学术会议论文汇编[C];1995年
5 杜民权;刘宁慧;樊明文;凌均启;;变形链球菌表面蛋白质抗原Ⅰ/Ⅱ的纯化和鉴定[A];全国第四次牙体牙髓病学术会议论文汇编[C];1995年
6 边专;谭海平;樊明文;赵心臣;;套式聚合酶链(PCR)快速检测人类唾液中变形链球菌和茸毛链球菌[A];中华口腔医学会第二次全国会员代表大会暨第七次全国口腔医学学术会议论文汇编[C];2001年
7 李月恒;周智;陈娇;尹一兵;张雪梅;;LuxS基因缺陷对变形链球菌相关生物学性状影响的初步研究[A];全国第八次牙体牙髓病学学术会议论文汇编[C];2011年
8 刘筱娣;郭丽宏;;变形链球菌thrS基因敲除菌株的构建[A];2007年第七次全国牙体牙髓病学学术会议论文集[C];2007年
9 张志民;赵洪岩;朱来宽;;采用非标记定量技术对变形链球菌耐氟菌株的差异蛋白质组学研究[A];全国第八次牙体牙髓病学学术会议论文汇编[C];2011年
10 刘加荣;边专;樊明文;张汉东;曾久荷;;变链素基因在人群中的分布[A];2007年第七次全国牙体牙髓病学学术会议论文集[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 卫华;变形链球菌耐酸性相关基因的研究[D];武汉大学;2004年
2 杨德琴;不同龋敏感人群变形链球菌产酸耐酸毒力因子遗传多态性研究[D];四川大学;2005年
3 张志民;变形链球菌耐氟菌株和亲代菌株蛋白质组表达谱及其数据库的初步构建[D];吉林大学;2010年
4 刘佼佼;不同致龋性变形链球菌临床分离株差异ssDNA配基的筛选和鉴定[D];中国人民解放军军医进修学院;2011年
5 姜广水;抗变形链球菌表面蛋白抗原唾液结合区段防龋疫苗实验研究[D];山东大学;2005年
6 卫克文;变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因克隆、表达及免疫防龋实验研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
7 赵洪岩;采用非标记定量技术对变形链球菌耐氟菌株的差异蛋白质组学研究[D];吉林大学;2011年
8 夏丽;变形链球菌非编码RNA的初步筛选及非编码RNA-L10-Leader的鉴定和相关检测[D];中国人民解放军军医进修学院;2012年
9 陆玉;变形链球菌糖代谢相关基因的差异性表达与其致龋性关系的研究[D];四川大学;2006年
10 陈明;灰色链霉菌RX-17产β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶基因的克隆、表达和耐酸性分子改造[D];山东大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 郑鹏;变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因gluA突变的检测[D];吉林大学;2010年
2 周智;鸡卵黄特异抗体对人口腔中变形链球菌影响的研究[D];江西医学院;2001年
3 崔岩;变形链球菌延伸因子(EF-Tu)tuf基因的克隆及序列分析[D];吉林大学;2007年
4 赵洪岩;变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因ffh突变的检测[D];吉林大学;2005年
5 方会清;老年人高龋患者牙菌斑中变形链球菌临床分离株致龋性的研究[D];第四军医大学;2006年
6 朱来宽;变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因fhs突变的检测[D];吉林大学;2007年
7 文冰;抗变形链球菌IgY抑制变链菌产酸及合成葡聚糖的实验研究[D];江西医学院;2000年
8 丁春燕;变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株的基因组比较[D];天津医科大学;2006年
9 余志芬;柠檬提取物对变形链球菌致龋相关酶活性及代谢产物的影响[D];天津医科大学;2010年
10 杨健;抗变链鸡卵黄抗体(IgY)对两种变形链球菌粘附的影响[D];江西医学院;2000年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 ;中国直缝埋弧焊管价格平稳[N];世界金属导报;2007年
2 江春;是非对错幼齿观[N];医药经济报;2006年
3 周虹;美丽牙齿吃出来[N];中国医药报;2008年
4 记者 张孟军;剖腹产婴儿更易患龋齿[N];科技日报;2005年
5 张会;牙齿健美要“挑食”[N];医药养生保健报;2007年
6 朱本浩;10种食物能固齿[N];中国中医药报;2007年
7 陶少清;新型高耐蚀性不锈钢石油管[N];世界金属导报;2006年
8 周伟;茶水漱口好处多多[N];卫生与生活报;2007年
9 周伟;茶水漱口好处多多[N];家庭医生报;2007年
10 刘彦宏;包装袋耐酸性案例分析[N];中国包装报;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978