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脂质体蛋白转染方法比较及运用该方法制备结核特异性靶细胞

李峥  
【摘要】:脂质体(liposome)是由磷脂及其他附加成分形成的一种双分子层小囊泡。由于这种双分子膜层具有生物膜特征,可与细胞融合,将脂质体囊泡中包裹的药物或其他成份导入细胞中。目前脂质体己广泛应用于制药、化妆品、农药等各个领域。 使某种细胞表达特异性蛋白我们常常选用核酸转染,其中脂质体转染法效率最高。现在有很多脂质体转染试剂面市,转染技术也很成熟。不过随着蛋白技术的发展,蛋白质学时代的到来,脂质体作为蛋白载体导蛋白入细胞技术也逐渐得到重视。脂质体可以与细胞膜融合而只将蛋白导入细胞,进入细胞后蛋白可以按照外源性蛋白的加工和递呈过程,通过细胞内溶酶体加工处理成多肽,然后和MHC分子一同递呈到细胞膜表面。但与脂质体作为核酸载体转染技术相比,其相应的试剂,方法及转染效率还没有比较完善的报道。 脂质体制备技术有很多种,较常用的为逆相蒸发法和冻融—超声法。本研究拟通过这两种制备脂质体的方法,探讨脂质体导蛋白入细胞的可行性。并尝试运用这一新方法制备结核特异性靶细胞。 目的:比较不同方法制备包裹蛋白脂质体的包封率和转染率。探讨转染的可行性。运用基因转染和蛋白导入两种方法制备结核特异性靶细胞,比较两种方法的转染效果。 方法:利用逆相蒸发法和冻融超声法制备包裹人IgG的阳离子脂质体,测定包封率并分别转染小鼠脾细胞,用流式细胞术,免疫荧光法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和免疫印迹法检测转染效果。用Biontex试剂盒瞬时转染pcDNA3.1—Ag85B质粒入小鼠黑色素瘤细胞。同时用脂质体将结核杆菌滤液蛋白导入小鼠黑色素瘤细胞。转染法设两组:对照组(未转染Ag85B质粒的正常小鼠黑色素瘤细胞)和转染Ag85B质粒组。每组设两个复孔。导蛋白法设两组:对照组(未导入滤液蛋白组的正常小鼠黑色素瘤细胞)和导滤液蛋白组,每组同样设两个复孔。用结核病人血清作一抗,荧光标记鼠抗人IgG作为二抗,流式细胞仪检测细胞膜表面荧光的表达率。 结果:逆相蒸发法制备的脂质体包封率高于冻融—超声法(P<0.01)。流式结果显示两种方法制备的脂质体转染率无显著性差异(P>0.05)。转染Ag85B质粒组细胞表面荧光表达率明显高于空白对照组;同样导滤液蛋白组细胞表面荧光表达率,明显高 于空白对照组:转染质粒组和导蛋白组在细胞量相同的情况下均按常规量进行两种方 法的转染,转染质粒组细胞荧光表达率为32.1%,导结核杆菌滤液蛋白组荧光表达率 为40.7%,所得荧光表达量无明显差异。 结论:逆相蒸发法制备的阳离子脂质体可以作为蛋白转染的载体有效地将目的蛋 白导入细胞。由结果可知基因转染和蛋白导入均能有效地使目的基因或蛋白成功进入 细胞并表达在细胞膜表面,均为行之有效地制备靶细胞和方法。两种方法在效果上无 明显差异,可根据具体条件来选择较为合适的方法。


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