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大型药用真菌蛋白AAL基因的鉴定及诱导细胞凋亡机制的研究

仝鑫  
【摘要】:根据以前测定的AAL N端序列设计了简并PCR引物,利用mRNA polyA设计了反转录引物以及下游PCR引物,用杨树菇菌丝体提取总RNA作为反转录模板,用RT—PCR方法得到了AAL的cDNA,长635bp,编码158个氨基酸,蛋白分子量为16993.75Da,其中含有蛋白质测序得到的N端(QGVNIYNI)序列和随机序列(QPDGPWLVEQR)。蛋白分子量和所含两个片段均证明此cDNA即为AAL的基因。通过Genbank搜索,通过氨基酸序列比较发现它属于Galectin蛋白家族。对该基因进行了原核表达和纯化并测定了该重组蛋白的凝血活性,发现重组蛋白与天然蛋白的凝血活性没有差异。 以AAL为诱饵蛋白,利用15肽噬菌体展示技术筛选得到了6个克隆,经测序,发现这6个克隆共享一个15肽片段QADGPNSVVRPFTLT。在GeneBank里搜索,发现该短肽和法尼基转移酶α亚基(Farnesyltransferase α,FTase α)中的一段具有同源性,所以推测AAL蛋白可能和FTase α相互作用。为了验证这个想法,首先通过RT—PCR方法从HeLa细胞中克隆了FTase α基因,然后构建了酵母双杂交载体pGAD-FT和pGBK—aal,以及这两个蛋白的真核表达载体pCMV—FT和pHM6—aal,最终利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术证明了FTase α和AAL相互作用。 为了阐明AAL与法尼基转移酶作用后的下游事件,我们检测了Ras在膜上的变化和细胞内Fas的变化以更详细的阐述AAL诱导细胞凋亡的机制。首先用AAL


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