诱导型激活拟南芥突变体库的构建以及AtCRK3生化、表达分析

【摘要】：本课题主要是由两个部分组成。一个部分是通过化学诱导激活标签构建拟南芥突变体库,并从中筛选到两个盐信号突变体;另外一个部分是对拟南芥中的AtCRK3蛋白进行了生化、生理方面的研究。 在植物功能基因组研究中,突变体在研究基因功能方面起到十分重要的作用。由于拟南芥具有较小的基因组、高效的转化方法以及已完全测序的Col-0型基因组序列,目前已是一种很重要的模式植物,因而在拟南芥突变体库构建中建立出一种有效的基因标签系统就显得十分重要。在化学诱导型启动子/增强子标签系统(PER16)中,目标基因的转录是受到雌激素严格调控的:在加入了雌激素的条件下,目标基因可达到的转录水平是35S启动子的8倍,在没有雌激素诱导的条件下,目标基因的转录则不能被检测到,另外所施加的雌激素对转基因拟南芥没有明显的毒性。因为PER16系统具有很多其它系统不具有的优点,所以将PER16载体随机插入到拟南芥基因组中构建成突变体库是一种十分有效的研究基因功能的方法,可以让我们在研究中发现到一些在其它组成型增强子调控下而导致生长收到严重影响甚至致死型的突变体。此部分的主要实验结果如下: 在拟南芥转化实验中,采用的是Col-0型拟南芥,农杆菌菌株为GV3101,通过农杆菌侵染方法(floral dip),将基于雌激素受体的化学诱导激活标签系统PER16转入拟南芥中。通过优化拟南芥的栽培、转化以及转基因植株的筛选方法,建立了一个稳定的技术平台,转化效率一般为1～2%。通过这个转化系统最终得到了22,000株含有PER16的插入株系。通过PCR鉴定了其中40株转基因株系的T-DNA的插入,发现其中有一株没有T-DNA插入,插入比例为97.5%。通过Kan抗性筛选,统计了其中1000株转化株系的T2代种子的Kan抗性分离比,发现平均每个转基因株系中含有1.5个T-DNA标签。这表明在此突变体库中拟南芥基因组上共有33,000位点被插入标记。另外和其他几位同学从本突变体库T2代种子中筛选出几个形态方面突变体,其中一株属于雌激素诱导表达型突变体,而此基因的插入失活突变体则没有明显的表型。以上结果表明已成功的构建了诱导型激活拟南芥突变体库。 对来源于本实验室构建的诱导型激活拟南芥突变体库的200,000粒T2代种子进行了盐信号突变体的筛选。盐耐受突变体的筛选方法是挑取能够在含有250mM NaCl固体培养基上萌发的拟南芥突变体,最后我们得到1株突变体,称之为high salt tolerant l