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喜树胚轴悬浮培养细胞喜树碱生物合成影响因素的研究

潘学武  
【摘要】:喜树碱(Campothecin),一种色氨酸衍生的水不溶性萜烯类吲哚生物碱,它首先是从我国特有树种.喜树(Campototheca acuminata Decaisne)茎的提取物中分离得到的。喜树碱类药物通过抑制肿瘤细胞内拓扑异构酶I的活性而具抗癌效应,这一作用机理为肿瘤细胞的治疗开辟了又一新的途径,拓扑异构酶I抑制剂喜树碱类药物已成为高选择性抗肿瘤药物研究的一个主攻方向,成为又一新的世界性热门研究课题。喜树碱的两种衍生物,irinothecan和topotecan已于1996年得到美国食品与药品监督管理局(FDA)的批准用于临床,分别治疗乳腺癌和结肠癌。同时,9-硝基喜树碱已完成针对晚期胰腺癌的Ⅲ期临床研究,正向美国FDA提出新药申请,其它的如10-羟基喜树碱,exatecan,lurtotecan等正处于各级临床实验。 随着喜树碱类药物临床研究和开发的不断升温,世界市场上喜树碱类药物的需求不断加大,可持续获取喜树碱及其类似物必定是喜树碱类药物研究的重点之一。单纯靠从植株中提取喜树碱已不能满足市场的需要,利用植物细胞培养法生产喜树碱是一有益的新探索。在这方面,虽然国外的一些研究小组率先进行了研究,但相比其它植物如紫草,人参,黄连,长春花,红豆杉等而言,喜树细胞培养还仅仅处于初始阶段,因此,深入详细地研究喜树细胞悬浮培养生产喜树碱类药物无疑将具有极其重要的应用价值和理论意义,同时为以后生物反应器放大培养提供试验参数,本研究的主要结果如下: 1.对不同外植体愈伤组织的诱导表明,以MS为基本培养基,0.2-2.0mgl~(-1)的2.4-D为激素,25℃暗培养,可以在2-3周内获得高达100%的喜树不同外植体来源的愈伤组织发生率,愈伤组织在附加0.5mgl~(-1)2.4-D的MS培养基中继代生长良好,胚轴来源的愈伤组织喜树碱产量最高,达到0.034mg flask~(-1)。 胚轴来源的细胞悬浮培养体系的建立显示,下胚轴诱导的愈伤组织在MS培养基中细胞生长良好,最佳激素组合为0.2mgl~(-1)2.4-D+0.5mgl~(-1)NAA+0.5mgl~(-1)6-BA,细胞继代周期以21d左右为宜,悬浮细胞适合在22℃-26℃,120rpm下生长。悬浮培养细胞在第20天生物量达到最大,为27.44gl~(-1)DW。在细胞对数生长期内,喜树碱积累与细胞生长呈线形正相关性,第20天喜树碱含量达到最大值0.009319%,喜树碱产量为2.56mgl~(-1)。 2.通过改变MS培养基中氨态氮与硝态氮的不同摩尔比例以及初始总氮源来提高喜树悬浮培养细胞的生长和喜树碱的生物合成。在MS培养基中,70mM的硝酸盐而去掉铵盐,悬浮培养细胞的生长最快;而当氨态氮与硝态氮的摩尔比为5:1,总氮源为40mM时,悬浮培养细胞喜树碱的生物合成能力最强。通过改变氮源的两步


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