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苏云金芽孢杆菌酪氨酸酶纯化、性质研究及其mel基因的克隆和表达

刘楠  
【摘要】:mel基因编码的产物为酪氨酸酶。该酶催化底物L-酪氨酸形成L-多巴,并经过一系列的氧化反应形成黑色素。黑色素具有多种重要的生理功能,特别是其抗紫外线、清除自由基的功能及其应用价值倍受关注,形成一新的研究热点。苏云金芽孢杆菌是目前世界上应用最广泛的微生物杀虫剂,但是其在大田中的应用因为伴孢晶体受紫外线辐射易失活而受到限制。我们实验室在研究过程中发现几乎所有亚种的苏云金芽孢杆菌在42℃条件下均可以产生黑色素,这为苏云金芽孢杆菌的广泛应用奠定了重要的理论基础。 本研究利用“一步过柱法”纯化了苏云金芽孢杆菌的酪氨酸酶,并且对其酶学性质进行了研究,发现该酶除具有酪氨酸酶共有的性质外,还有许多独特的性质,如热稳定性、底物特异性、被高浓度EDTA激活等。苏云金芽孢杆菌酪氨酸酶独特的性质使其成为研究蛋白质结构和功能关系的理想模式酶。 本研究进一步使用“鸟枪法”克隆到了苏云金芽孢杆菌酪氨酸酶基因(mel),以pUC18为载体构建了含有mel基因的质粒pBM,在大肠杆菌中获得了较好的表达。同时,我们还将苏云金芽孢杆菌mel基因亚克隆到枯草芽孢杆菌表达质粒pBE2上并在枯草芽孢杆菌中也获得了表达。对克隆到的mel基因进行的序列分析和同源比较显示该基因是一个典型的酪氨酸酶,其氨基酸序列具有酪氨酸酶特有的活性保守区域。我们对苏云金芽孢杆菌酪氨酸酶结构的初步分析显示此蛋白在二级结构上与其他来源的酪氨酸酶有明显的区别。 此外,我们还考察了产黑色素苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的表达情况,发现伴孢晶体的全部表达依赖于30℃预培养。同时,伴孢晶体的表达和芽孢形成、黑色素的


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