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线粒体靶向药物设计合成及其应用基础

戚祖德  
【摘要】:线粒体起源于15亿年前的真核细胞与细菌之间的内共生体,是细胞中重要的细胞器。它提供了细胞所需能量、调节细胞Ca2+的动态平衡、维持细胞的电势平衡作用、参与细胞凋亡过程及衰老等多种病理生理的代谢过程,已经成为许多疾病的药物作用靶点。由于线粒体DNA没有内含子仅有外显子,非常容易受到外界损伤。而且线粒体的功能缺失或改变,不仅影响细胞的生长、代谢和增殖等过程,还会触发机体发生依赖线粒体的病变。线粒体是提供给细胞的能量“工厂”,控制线粒体的能量代谢也就控制了细胞的生长情况,因此线粒体是最为有效的治疗癌症和其它疾病的作用靶点。 电子移位亲脂性阳离子(Delocalized Lipophilic Cation, DLC)是一类具有亲油和亲水双亲性阳离子化合物。它能够在线粒体跨膜电位的推动下,聚集于细胞线粒体部位。由于肿瘤细胞的线粒体膜电位高于正常细胞,可提供推动力使DLC在肿瘤细胞线粒体内选择性的积聚,而DLC在高浓度下将表现出线粒体毒性,导致肿瘤细胞死亡。F16是具有DLC类物质的特性,它能够通过细胞膜和线粒体膜的疏水屏障,并在线粒体内膜膜电位(membrane potential,△Ψm)的电场力推动下,进入到线粒体基质。本论文利用F16这些特性,把F16作为母体或者携带载体,设计了系列化合物应用于线粒体靶向药物。本文主要内容由以下几部分组成: (1).我们首先合成了F16的三个衍生物(1,2,3),利用荧光、紫外、时间分辨和荧光偏振,研究了这三个化合物在琥珀辛酯磺酸钠(Bis(2-ethylhexyl)sodium sulfosuccinate)制备的反向微乳液和牛血清蛋白溶液中的微环境的光谱性质。荧光和紫外的研究结果表明:发现化合物1(即F16)与微乳液作用时是以嵌入的方式进入微乳液的Stem层,并与阴离子表面活性剂发生静电相互作用;而化合物2,3不是嵌入的方式进入Stern层中。1的这种嵌入方式与其结构刚性有很大关系。通过MTT的结果表明:1的细胞毒性比2和3都要好。因此,药物能够选择性识别线粒体必须能够经受亲水和疏水作用,而且须具备刚性结构,通过刚性化合键的耦合作用使正电荷游离于整个分子。电子移位亲脂阳离子(DLC)的研究给人提供了一个作为靶向线粒体给药系统研究方向;同时反向微乳液提供了一个模拟细胞膜的研究体系,作为研究生物活性分子具有重要意义。 (2).我们进一步合成了F16与5-氟尿嘧啶通过烷烃的连接物(F16-5-FU),在近似生理条件下,用荧光、紫外和分子对接技术,研究了F16-5-FU与BSA之间的相互作用;探讨了它们之间的作用模式,计算了结合常数和结合的热力学参数。实验结果表明:两者的相互作用是两者之间发生动态碰撞而使BSA的荧光发生猝灭。我们进一步通过的HSA SiteⅠ和:SiteⅡ两个位点探针与药物F16-5-FU进行位点竞争,发现F16-5-FU处于蛋白质SiteⅡ上。分子对接实验进一步确定了它们的结合位点、作用力和作用模式,并与实验结果相符。 (3).我们成功合成了溴卟啉与前体F16之间的连接,应用于光动力疗法中。通过改变卟啉结构,发现卟啉的结构对化合物的溶解度有非常重要的影响,甚至影响细胞对药物的吸收。卟啉与F16的连接之间发生了能量转移,但没有影响卟啉的电子结构,它们产生单线态氧的产率没有发生明显的增大,但是它们在光动力疗法中比H2TMPyP要好很多。而卟啉上连接了稀土元素镱(Ytterbium, Yb)之后,卟啉的能量转移给Yb后,其单线态氧量子产率发生明显降低,造成在光动力疗法中效果非常差。F16能够发挥诱导细胞凋亡,而卟啉在光照情况下,能够发挥其光敏剂的作用。因此,我们合成的化合物A和B发挥了两者共同的作用,在光照的情况下细胞发生了凋亡现象,但由于卟啉的溶解性问题导致分子被细胞吸收后在细胞内发生聚集的现象。卟啉本身的溶解性问题导致了其顺利进入癌细胞线粒体。此种设计思路可以为进一步研究靶向给药和光敏剂诱导细胞凋亡提供有利证据和研究方向。 (4).我们利用一个简单方法,对双亲性高分子进行修饰后来包裹油溶性量子点,并与水溶性卟啉进行连接应用于光动力疗法。此种包裹方法由于没有破坏量子点,所以它不仅能够保持原有的荧光强度,而且能够免受生物体的酶体系降解,达到降低量子点的毒性。卟啉与量子点连接后,量子点主要通过非Forster能量转移(non-FRET)的方式,把能量转移给卟啉。通过控制量子点与卟啉的摩尔比,用双光子激发量子点,能量转移给卟啉,从而产生单线态氧。此种体系能够提高光动力疗法的光源透过皮层组织的深度,能够治疗更深组织的癌组织。而且此种纳米给药体系能够在双光子激发下,能够增强卟啉产生的单线态氧产率。


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