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药用真菌杨树菇Agrocybe aegerita非多糖水溶性抗肿瘤组分研究

梁一  
【摘要】:大型真菌入药在我国已经有两千多年的历史,世界上第一部药物专著《神农本草经》即记载了灵芝、茯苓、雷丸、猪苓等药用真菌的药效,其具有抗肿瘤、抗病毒、降胆固醇、降血压、抗血小板凝集等活性,尤其抗肿瘤活性引人注目。20世纪50年代,Lucas等人发现几种担子菌子实体的提取物可明显抑制S180细胞的生长,随即药用真菌的抗肿瘤活性成分引起了世界各国科学家的注意。传统观点认为,多糖是药用真菌中主要的抗肿瘤组分。但到目前为止,多糖也仅作为肿瘤治疗的辅助药物使用。药用真菌中是否还有其他重要的抗肿瘤活性成分? 我们小组从药用真菌杨树菇中提取一种活性蛋白提取物Yt,对肿瘤细胞和荷瘤小鼠都具有很强的抗肿瘤活性,且使用同样的方法提取其它三种药用真菌(虫草、灵芝、香菇)的活性蛋白组分在荷瘤小鼠上都表现出相似的抗肿瘤活性。因此,我们提出:除多糖以外,活性蛋白组分是药用真菌抗肿瘤活性的重要成分。 首先Yt通过高碘酸-schiff染色法及苯酚硫酸法鉴定为几乎不含多糖成分。使用大孔吸附树脂HP20将Yt分离成Yp (Y-protein,蛋白组分)和Ys (Y-small molecule,小分子化合物),两者各占Yt的59%和41%。2D-gel分析Yp,显示其中蛋白组分约20种,结合质谱测序,仅鉴定到Yp中的3种蛋白(2种lectin和1种丝氨酸蛋白酶),其余蛋白为未知蛋白。 Yt对肿瘤细胞(H22、HepG2、HeLa、Hep3B)表现出显著的细胞毒性,对肿瘤组织(S180)具有明显的抑制作用;而对成纤维细胞NIH3T3毒性很低,对正常肌肉组织没有明显毒性。在荷H22的BALB/c小鼠模型上检测到Yt具有显著的抗肿瘤活性,且明显延长小鼠生存期;Yt的抗肿瘤效应有记忆性。我们还对瘤内注射Yt的初步毒理学进行分析,发现瘤内注射Yt不会引起大量抗体的产生;不影响小鼠体重的增加;对各器官组织无明显病理影响;对雄性荷瘤小鼠精子活率有抑制作用。在荷瘤裸鼠模型中Yt的抗肿瘤活性并不明显,但可延长小鼠生存期。 Yt对免疫调节的活性研究发现,Yt可增强体外Con-A对小鼠脾脏淋巴细胞的活化能力;瘤内注射Yt可增强荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞的细胞介导毒性作用;显著上调脾脏Th-1型细胞因子IL-2, TNF-α, IFN-γ的mRNA水平,显著下调Th-2型细胞因子TGF-p的mRNA表达水平;显著上调血清中细胞因子IL-2的蛋白表达水平。 在荷瘤(H22)小鼠模型中进一步检测Yp与Ys的抗肿瘤活性,发现Yp抗肿瘤活性优于Ys。初步毒理学研究表明,Yp, Ys对荷瘤小鼠没有明显的毒性。使用蛋白酶K处理Yp,发现处理后的Yp抗肿瘤活性及对小鼠生存期的延长能力都有明显下降,说明Yp中蛋白质是主要的活性成分。瘤内注射Yp, Ys后,Yp可上调小鼠脾脏细胞因子IL-10, TGF-β, Ys可上调GM-SCF的表达,但两者对小鼠血清细胞因子IL-2和TNF-α的蛋白水平没有显著影响。 由于Yt通过直接杀伤肿瘤细胞和免疫调节两方面发挥抗肿瘤活性,我们推测瘤内注射的Yt直接杀死肿瘤细胞,并引起强烈的免疫反应,导致肿瘤消退。因此,我们模拟Yt瘤内注射治疗肿瘤过程,将Yt与全细胞肿瘤疫苗(UV杀死的肿瘤细胞)混合使用,检测Yt在全细胞瘤苗中的佐剂作用。全细胞瘤苗及Yt+全细胞瘤苗免疫小鼠均对小鼠具有100%的保护作用,并有记忆性。单独使用全细胞瘤苗,不能在不同肿瘤细胞株之间产生100%的交叉保护,而Yt+全细胞瘤苗可以使不同肿瘤之间产生100%的交叉保护。全细胞瘤苗在裸鼠模型完全失去保护作用。用单抗体内封闭CD4+, CD8+T细胞,用包裹氯磷酸二钠的脂质体(liposome-clodronate, liposomeclodr)体内封闭巨噬细胞,都会使全细胞瘤苗的保护作用降低。进一步研究发现,这种全细胞肿瘤疫苗的保护作用依赖于免疫的频率,细胞表面的糖基修饰,核酸组分及细胞的完整性。


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