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Ca_v1.2谷氨酸替换突变对离子通透及电压门控性质的影响及其相关机制

李喆  
【摘要】: 背景 电压门控性钙通道(voltage-gated calcium channel, VGCC)是心肌细胞的主要钙通道,在兴奋收缩耦联及电信号传导中发挥着极其重要的生理功能,也是多种抗心律失常药物作用的靶通道。有关电压门控性钙通道离子通透机制的研究开展了多年,已明确通道孔道区(pore)的由四个谷氨酸构成的选择性滤器(EEEE, Selectivity Filter)对钙离子具有高度选择性,参与通道的离子通透和电压门控功能的发挥。但选择性滤器不足以解释通道的所有特性,故有多种假说推论通道结构中存在其他钙离子结合区域,但存在部位以及其发挥功能的具体机制尚不清楚。本研究通过基因突变,将可能与Cav1.2通道功能相关区域的氨基酸残基进行替换,用全细胞膜片钳法记录突变体的钙电流及钡电流,分析突变通道离子通透及电压门控性质的变化,以确定该氨基酸残基在通道结构功能中的作用,以期进一步探讨钙通道的功能机制。 第一部分 目的比较野生型Cav1.2通道及其功能相关区域突变通道对钙及钡离子的选择性通透及电压门控特性,观察突变对通道离子通透及电压门控性质的影响。 方法通过基因点突变将Cav1.2通道功能相关区域的氨基酸依次替换为谷氨酸(序列号1121-1136),得到13个基因突变通道。将野生型Cav1.2通道和突变通道表达在培养的人胚肾细胞293 (HEK 293)中。用全细胞膜片钳使用钙、钡离子外液微灌注同一细胞,记录钙、钡电流得到电流—电压(current-voltage,Ⅰ-Ⅴ)关系曲线以及稳态激活(steady-state activation, SSA)曲线。通过标准化拟和分析得到野生型Cav1.2及13个突变通道对钙离子及钡离子反转电位(Erev)、稳态激活斜率(slope)、半数激活电压(Vh)以及最大钡电流与最大钙电流之比(IBa(max)/ICa(max))等描述通道离子选择及电压门控特征的参数,以发现对通道离子选择性通透及电压门控性质有影响的突变通道。 结果研究结果显示,野生型通道的离子选择和电压门控性质与之前的研究结果一致,最大钡电流与最大钙电流之比IBa(max)/ICa(max)≈2,钙电流与钡电流的半数激活电压之差为~10 mV。而在13个基因突变通道中,序列号为1126的突变通道的离子通透及电压门控性质发生了变化,其消除了钙通道对钙、钡离子的选择性差异,其IBa(max)/ICa(max)≈1,并且钙电流与钡电流的半数激活电压无显著性差异。其中钡电流半数失活电压较野生型进一步去极,而钙电流半数失活电压较野生型无明显改变。 结论发现在Cav1.2功能相关区域的突变通道中,序列号为1126的突变通道是唯一影响通道对钡离子及钙离子选择性通透及电压门控特性的突变通道,其消除了通道对两种离子的选择性差异及电压门控差异。 第二部分 目的比较野生型CaV1.2通道和序列号为1126的突变通道F1126E对钙离子及钡离子的电导系数(conductance, G)、单位电流幅度(unitary current amplitude, i)、阻断锂离子(block of Li+)的量效关系以及饱和—电导(saturating-conductance)关系,明确F1126E改变通道离子通透性质的发生机制。 方法将野生型Cavl.2通道和突变通道Fl 126E表达在培养细胞HEK293中,用全细胞膜片钳使用钙、钡离子外液微灌注同一细胞,记录钙、钡电流的瞬时电流—电压(instantaneousⅠ-Ⅴ,ⅡⅤ)关系曲线,通过标准化拟和分析得到野生型Cavl.2通道和突变通道F1126E对钙离子及钡离子的相对电导系数(GBa,GCa)以及对钡离子电导系数与钙离子电导系数之比(GBa/GCa),并运用非稳态噪声分析(nonstationary noise analysis)方法计算钙、钡离子的单位电流幅度。同时,通过记录钙、钡离子阻断锂离子得到量效关系,来探讨突变通道对选择性滤器的高亲和力结合机制的影响;并通过记录通道对不同浓度的钙、钡离子的饱和—电导关系,以探讨突变通道对孔道内多个二价离子的相互作用的影响。 结果研究结果显示,野生型通道对钡离子电导系数与钙离子相对电导系数之比与之前的研究结果一致,GBa/GCa≈2,而F1126E对钡离子电导系数与钙离子电导系数却没有显著性差异,GBa/GCa≈1,通过对野生型Cav1.2通道和F1126E对钙离子及钡离子的相对电导系数(GBa,GCa)的比较,发现F1126E对钡离子的电导系数GBa较野生型显著性降低,而GCa较野生型无显著性变化。通过非稳态噪声分析发现突变通道的钡离子单位电流幅度明显降低并和钙一致,而对钙离子无显著影响。此突变通道没有改变钡或钙离子对锂电流的半数—最大阻滞性质,却使孔道与多个钡离子的相互作用变得与钙一致,亦对钙离子无显著影响。 结论F1126E消除通道对钡离子和钙离子的选择性差异的机制是使孔道内多个钡离子相互作用发生变化,从而降低钡离子的电导系数,减小了钡电流,而对通道选择性滤器的高亲和力结合机制及钙离子的通透特性并无显著影响。 第三部分 目的记录F1126E突变通道的稳态失活(steady-state inactivation, SSI)以及关闭状态去激活(close-state deactivation)性质,进一步明确F1126E改变通道电压门控性质的发生机制。采用丙氨酸(A)替换1126位氨基酸残基得到突变通道F1126A来探讨F1126E改变通道电压门控特性的机制。 方法记录F1126E通道的钙、钡电流的稳态失活曲线以及瞬时电流—电压关系曲线,通过标准化拟和分析得到野生型Cav1.2通道和突变通道F1126E对钙离子及钡离子的稳态失活斜率、半数失活电压、去激活时间常数(T),进一步探讨F1126E改变通道电压门控特性的发生机制。并通过基因点突变将Cav1.2的1126位氨基酸残基得到突变通道F1126A,并表达在培养细胞HEK293中,用全细胞膜片钳记录钙、钡离子电流,得到F1126A的SSA曲线,拟和得出该通道的半数激活电压。 结果研究结果显示,去激活时间常数及F1126A突变通道的半数激活电压与野生型钙通道没有差异。野生型通道的稳态失活及关闭状态去激活性质与之前的研究结果一致,钙电流与钡电流的半数失活电压之差为~10 mV。而F1126E突变通道的钙电流与钡电流的半数失活电压均无显著性差异,钡电流半数失活电压较野生型进一步去极,而钙电流半数失活电压较野生型无明显改变。 结论1126位点并不是通道内的一个钙离子结合位点。F1126E消除通道对钡离子和钙离子电压门控特性的差异的机制包括钡电流半数失活电压较野生型进一步去极以及去激活时间较野生型加快,而钙电流半数失活电压以及去激活时间较野生型均无明显改变。 总结 本研究在国内首次通过基因突变将钙通道功能相关区域的氨基酸残基进行依次替换,以探讨每一个氨基酸残基在钙通道结构中的作用。在国内首次运用对同一细胞先后记录钙电流及钡电流的全细胞膜片钳方法,以观察对两种离子的选择性通透及电压门控特性,进一步深入探讨钙通道的离子通透机制和电压门控机制。研究发现在所有13个研究对象中,有一氨基酸残基与钙离子通道的离子通透特性以及门控特性均密切相关。本研究结果说明钙离子通道的离子通透特性和电压门控特性是相互关联的,通道外部前庭的氨基酸残基参与形成了一个钙离子选择性结合位点,这一研究成果为钙通道机制学的进一步研究奠定了又一崭新的基础。


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