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抑制NADPH氧化酶对心力衰竭兔心脏电—机械活动的影响及其机制

刘育  
【摘要】:心力衰竭(心衰)是各种病因致心脏病的严重阶段,发病率高,严重影响患者生活质量,增加致残率和致死率,但当前针对心衰的治疗措施还不足以遏制心衰进展。因此,加强对心衰发病机制的研究将有助于制定更为有效的治疗方案。 心衰时心肌细胞内钙离子调控出现明显异常,细胞间电耦联降低,细胞间质出现纤维化,是引起心肌收缩功能受损和心律失常发生的主要机制。循证医学证据表明,仅在室性心律失常发生后再进行干预的下游治疗不足以达到现代抗心律失常标准:①遏制心律失常发生;②降低心律失常死亡率;③降低总死亡率。因此,寻找针对室性心律失常形成的基质的干预措施,即上游性治疗,是目前防治室性心律失常的新思路。 基础与临床研究发现心衰时心肌和血清中氧化应激水平升高,抗氧化治疗可以减轻心脏重构,提示氧化应激可能是促进心衰发生、发展的重要机制。基础研究业已证实,氧化应激与细胞凋亡、肥大、细胞外基质合成与降解、离子通道和转运体的表达和活性、细胞间电耦联关系密切。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶是心血管系统产生活性氧(ROS)的最主要来源。有研究发现,心衰时心肌NADPH氧化酶表达和活性增加,氧化应激水平升高,提示NADPH氧化酶可能是心衰发生、发展的重要分子基础,但NADPH氧化酶与心衰心脏电机械活动之间的关系尚未完全阐明。因此,本研究将通过观察抑制NADPH氧化酶对心衰兔心脏电机械活动的影响及其机制,试图阐明NADPH氧化酶在心衰发生、发展中的作用,为防治心衰提供新的干预靶点和理论依据。 目的:1、观察抑制NADPH氧化酶对心衰兔心脏功能和电活动的影响; 2、观察抑制NADPH氧化酶对心衰兔心肌钙调节蛋白和缝隙连接蛋白43的影响; 3、探讨抑制NADPH氧化酶对心衰兔心肌纤维化的影响及其机制。 方法:32只兔随机分为假手术安慰剂组、假手术apocynin (NADPH氧化酶抑制剂)组、心衰安慰剂组、心衰apocynin组。通过容量超负荷联合压力超负荷建立家兔心衰模型。apocynin和安慰剂以15mg/d口服。8周后,行超声心动图检查观察动物心脏结构和功能的变化。通过在体电生理研究分析兔左心室三层心肌单相动作电位复极90%的时程(MAPD90),观察室性心律失常诱发情况。通过细胞色素C还原实验测定心肌NADPH氧化酶活性。运用比色法检测心肌超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平。运用半定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测心肌钙泵(SERCA2a),雷诺受体(RyR2),受磷蛋白(PLB)和钠钙交换体(NCX)的基因和蛋白表达。运用比色法测定心肌SERCA2a活性。应用实时定量PCR (Real-time PCR)和Western blot法检测心肌缝隙连接蛋白43(Cx43)的基因和蛋白表达。通过组织形态学分析心肌纤维化程度。运用Real-timePCR检测心肌转化生长因子β(TGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的基因表达。 结果:1、与假手术安慰剂组相比,心衰安慰剂组动物左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期容积(LVEDV)和左室收缩末期内径(LVEDS)均显著增大(P0.05);左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短分数(LVFS)明显降低(P0.05);三层心肌MAPD90延长(P0.05),室性心律失常诱发增多;心肌NADPH氧化酶活性增加(P0.05),SOD活力降低(P0.05),MDA水平升高(P0.05)。与心衰安慰剂组相比,心衰apocynin组LVEDD、LVESD、LVEDV和LVEDS缩小(P0.05); LVEF和LVFS显著提高(P0.05);三层心肌MAPD90缩短(P0.05),室性心律失常诱发减少;心肌NADPH氧化酶活性降低(P0.05),SOD活力升高(P0.05),MDA水平降低(P0.05)。假手术apocynin组上述指标较假手术安慰剂组无明显差异。 2、与假手术安慰剂组相比,心衰安慰剂组动物心肌SERCA2a、RyR2、PLB mRNA表达明显降低,NCX mRNA表达明显增加(P0.05); SERCA2a和PLB蛋白表达明显降低(P0.05); SERCA2a活性显著减弱(P0.05);Cx43 mRNA和蛋白表达表达显著降低,且以磷酸化Cx43降低为主(P0.05)。apocynin对假手术组动物上述指标没有明显影响,但明显升高心衰动物心肌SERCA2a和PLB mRNA和蛋白表达,增加RyR2 mRNA表达,降低NCX mRNA表达(P0.05),增强SERCA2a活性(P0.05),阻止Cx43 mRNA和蛋白表达降低(P0.05)。 3、与假手术安慰剂组相比,心衰安慰剂组动物心肌纤维化明显增多(P0.05);心肌TGF-β、CTGF、MMP-2和MMP-9基因表达显著升高(P0.05)。apocynin对假手术组动物上述指标没有明显影响,但显著改善心衰兔心肌纤维化程度(P0.05),降低心肌TGF-β、CTGF、MMP-2和MMP-9基因表达(P0.05)。 结论:1、容量超负荷联合压力超负荷可成功制作家兔心衰模型。抑制NADPH氧化酶可明显改善心衰动物心脏收缩功能和电生理异常,降低室性心律失常风险。 2、抑制NADPH氧化酶可改善心衰时心肌钙调节蛋白异常表达和细胞间缝隙连接重构,这可能是其改善心衰时异常电机械活动的重要机制; 3、抑制NADPH氧化酶可通过下调心肌TGF-β、CTGF、MMP-2和MMP-9基因表达改善心衰动物心肌纤维化,这可能是其改善心衰时异常电机械活动的机制之一。


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